HPLC法測定鹽酸普拉克索的有關物質

于 峰，張曼紅，劉建洋

(山東紳聯藥業有限公司，山東 濟南 250000)

鹽酸普拉克索(pramipexole hydrochloride)是一種非麥角類選擇性多巴胺(DA)受體激動劑，與多巴胺受體D2亞家族結合具有高度的選擇性和特異性，對其中的D3受體有優先親和力，并具有完全的內在活性，能有效改善早期及晚期帕金森病的運動癥狀，延緩和減輕左旋多巴導致的相關運動并發癥的發生，使用范圍廣，安全性好，目前已成為抗帕金森病治療的一線藥物[1-3]。本品的原研廠家為德國勃林格殷格翰公司(Boehringer Ingellheim)，是2007年在我國批準上市的新型抗帕金森病藥物。臨床上與左旋多巴聯合使用可有效改善中晚期帕金森病患者的運動狀態，同時可緩解帕金森病患者伴發的抑郁癥狀，避免因長期使用左旋多巴造成的神經損害[4]，延緩治療時間及降低使用劑量，可大大提高患者的生活質量[5-6]。本試驗采用高效液相色譜法測定鹽酸普拉克索的有關物質，此方法靈敏度高，專屬性強，準確度高，可用于鹽酸普拉克索的有關物質檢查。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-15C高效液相色譜儀(SPD-M20A檢測器(DAD檢測器))；QUINTIX125D-1CN電子天平(賽多利斯公司)；FE-28臺式酸度計(梅特勒-托利多)。

1.2 試藥

鹽酸普拉克索樣品(自制，批號：191201、191202、191203)；鹽酸普拉克索對照品(化 學 名：(S)-2-氨基-6-丙氨基-4,5,6,7-四氫苯并噻唑二鹽酸鹽一水合物，來源：U.S.Pharmacopeia，批號：G0L469，含量：每1mg含C10H17N3S·2HCl·H2O0.998 mg)；雜質A對照品(化學名：(6S)-4,5,6,7-四氫-1,3-苯并噻唑-2,6-二胺，來源：Toronto Research Chemical Inc.，批號：21-XJZ-69-1，含量：98 %)；雜質B對照品(化 學 名：6S-N,N-二異丙基-4,5,6,7-四氫苯并噻唑-2,6-二胺二鹽酸鹽，來源：TLC PharmaChem,Inc.，批 號：1392-083A8，含量：98.5 %)；鄰硝基苯基硫乙酸對照品(化 學 名：(2-硝基苯基)硫代乙酸，來 源：Cato Research Chemicals Inc.，批 號：C3D-1077-1401，含量：98.7 %)；雜質Ⅰ對照品(化學名：鄰硝基苯磺酸，自制，批號：Y191001，含量：88.9 %(滴定))；雜質Ⅱ對照品(化學名：(S)-N,N-(4,5,6,7-四氫苯并噻唑-2,6-二基)雙(2-硝基苯磺酰胺)，自制，批號：Y181201，含量：94.0 %)；雜質Ⅲ對照品(化學名：(S)-N,N-二丙基-4,5,6,7-四氫苯并噻唑-2,6-二胺，自制，批號：Y191203,含量：98.6 %)；雜質Ⅳ對照品(化學名：(S)-2-硝基-N-正丙基-N-(2-(丙氨基)-4,5,6,7-四氫苯并噻唑)苯磺酰胺，自制，批號：191205，含量：98.9 %)；雜質Ⅴ對照品(化學名：(S)-N-(2-(二丙氨基)-4,5,6,7-四氫苯并噻唑)-2-硝基-N-丙基苯磺酰胺，自制，批號：191102，含量：96.8 %)；雜質Ⅵ對照品(化學名：(S)-2-硝基-N-(6-(丙氨基)-4,5,6,7-四氫苯并噻唑-2-基)苯磺酰胺，自制，批號：191104，含量：99.6 %)；乙腈(色譜純，ASTOON，4L/瓶)；水(市售純凈水，杭州哇哈哈哈集團)，其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

取鹽酸普拉克索約15 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為鹽酸普拉克索溶液。

取中間體1((S)-N-(2-氨基-4,5,6,7-四氫苯并噻唑-6-基)-2-硝基苯磺酰胺)約15 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加乙腈適量溶解，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為中間體1溶液。

取中間體2((S)-N-(2-氨基-4,5,6,7-四氫苯并噻唑-6-基)-2-硝基-N-丙基苯磺酰胺)約15mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加乙腈適量溶解，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為中間體2溶液。取雜質Ⅰ約5 mg，置50 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質Ⅰ溶液。

取雜質Ⅱ約10 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈適量溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為雜質Ⅱ溶液。

取雜質Ⅲ約5 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈適量溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為雜質Ⅲ溶液。

取雜質Ⅳ約5 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈適量溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為雜質Ⅳ溶液。

取雜質Ⅴ約10 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈適量溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為雜質Ⅴ溶液。

取雜質Ⅵ約5 mg，置50 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質Ⅵ溶液。

取雜質A約10 mg，置50 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質A溶液。

取雜質B約5 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈適量溶解，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，作為雜質B溶液。

取鄰硝基苯硫乙酸約5 mg，置50 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為鄰硝基苯硫乙酸溶液。

取上述溶液各1 mL，混勻，作為混合溶液。

2.2 色譜條件與系統適應性

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6×150 mm，5 μm)，以pH值 3.0緩沖液(取辛烷磺酸鈉5.0 g與磷酸二氫鉀9.1 g，加水1000 mL使溶解，用磷酸調節pH值至3.0)為流動相A，以pH值 3.0緩沖液-乙腈(30∶70)為流動相B，梯度洗脫(0 min～40 min，70 % A；40 min～45 min，0 % A；45.1 min～55 min，70 % A)流速1.5 mL·min-1，柱溫35 ℃，檢測波長264 nm，進樣量5 μL，稀釋劑為pH值 3.0緩沖液-乙腈(80:20)。試驗結果見表1，色譜圖見圖1。在選定試驗條件下各雜質均能實現基線分離。

表1 系統適應性試驗結果

圖1 專屬性試驗高效液相色譜圖

2.3 專屬性試驗

取本品約15 mg，精密稱定，按表2的破壞方法進行強制降解試驗。破壞后放冷，加稀釋劑稀釋至10 mL，濾過，取續濾液作為供試品溶液。取各供試品溶液5 μL，分別注入液相色譜儀，試驗結果見表3。由試驗結果可知，本品在高溫、酸、堿、光照降解條件下未見明顯雜質產生，較為穩定；氧化降解條件下，主要降解產物為氧化降解產物1和氧化降解產物2，分別占1.519 %和0.478 %。主峰與雜質之間均能實現基線分離，表明改方法專屬性良好。并根據降解前后峰面積計算物料平衡，結果見表3。

表2 鹽酸普拉克索強制降解試驗破壞條件

表3 強制降解試驗結果(面積歸一化法)

2.4 線性試驗

按線性試驗要求，配制系列濃度的的線性溶液，按“2.2”項下的色譜條件進樣，以溶液濃度(C)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，采用最小二乘法進行線性回歸，同時計算各雜質的定量限(LOQ)和檢測限(LOD)，結果見表4。

表4 線性試驗結果

2.5 精密度和穩定性試驗

采用2名實驗人員在不同時間、不同設備上，分別平行測定6份供試品溶液，其中雜質A和雜質B均未檢出，計算鄰硝基苯硫乙酸、其他最大單雜和總雜質含量的RSD(n=12)分別為4.6 %，2.0 %和2.3 %。

取新配制的對照品溶液和供試品溶液，室溫放置12小時，并于0，2，4，8，12 h時，精密量取各溶液5 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。對照品溶液主峰面積各時間點RSD為0.48 %，與0 h相比，無顯著性差異。供試品溶液中各時間點最大單個雜質和總雜質含量均小于0.1 %，RSD均為1.0 %，其他雜質均未檢出。結果表明，室溫條件下，對照品溶液和供試品溶液均在12 h內穩定。

2.6 回收率試驗

取鹽酸普拉克索適量，精密稱定，加稀釋劑制成每1mL含1.5μg的溶液，分別加入0.2%、1.0%、1.5%的雜質對照品溶液，按“2.2”項下的色譜條件進樣，按外標法以峰面積計算，鄰硝基苯硫乙酸、雜質A、雜質B的平均回收率(n=9)分別為99.1%，101.5%，98.2%，RSD分別為1.5 %，2.1 %，1.2 %。

2.7 樣品測定

取三批自研產品(批號：191201、191202、190203)，按“2.2”項下的色譜條件進行試驗，鄰硝基苯硫乙酸按外標法以峰面積進行計算，雜質A、雜質B和其它雜質按主成分自身對照法計算。結果見表5。

表5 樣品測定結果 %

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

根據合成工藝，鹽酸普拉克索在264 nm處有最大吸收，中間體1、中間體2、雜質A、雜質B、鄰硝基苯硫乙酸、雜質Ⅲ、雜質Ⅳ、雜質Ⅴ、雜質Ⅵ各工藝雜質均在264 nm波長附近有最大吸收，雜質Ⅱ在290 nm處有最大吸收。根據降解試驗結果，主要降解雜質氧化產物1和氧化產物2的特征吸收，二者在264 nm處均有較強吸收。因此，選擇264 nm作為本試驗有關物質檢測用波長，可將各雜質有效成分檢出，且分離度符合要求。

3.2 色譜條件

本試驗對流動相B中pH值 3.0緩沖液和乙腈的不同比例進行了篩選，并對梯度洗脫程序進行了考察，最終確定了流動相比例和梯度洗脫程序。在選定色譜條件下，各色譜峰之間均能達到有效分離，且各色譜峰純度均達100 %。

3.3 雜質含量計算方法

雜質A、雜質B的校正因子分別為0.6、1.0，雜質B校正因子在0.9～1.1范圍內，為嚴格控制產品質量，將雜質A、雜質B和其他未知單雜均采用不加校正因子的主成分自身對照法進行計算。鄰硝基苯硫乙酸校正因子為1.0，鄰硝基苯硫乙酸為遺傳毒性雜質，為嚴格控制產品質量，其含量采用外標法以峰面積進行計算。