基于問題導向的發酵工程實驗設計

劉龍祥

(濱州學院生物與環境工程學院，山東 濱州 256600)

1 實驗背景

黃河三角洲土地鹽堿地比重大、鹽堿程度嚴重，鹽土占濱州市土壤面積的16%。鹽堿農田基礎設施落后，土壤養分含量低，為追求高產，化肥、農藥、地膜普遍過量施用，傳統種養模式效益極低甚至虧損，導致農民收入低下，耕作積極性降低，長此以往，農民經濟來源得不到保障，無法實現脫貧致富。2018 年中央 1 號文件著重提出：要深入實施“藏糧于地、藏糧于技”戰略，穩步提升耕地質量，進行鹽堿地改良是保障國家糧食安全的有效途徑。現階段運用較多的養地策略即秸稈還田，但秸稈還田過程中秸稈降解速度較慢是現階段需解決的關鍵問題。因此，本節實驗以此問題作為導向，引導學生參與實驗設計與實施，以期培養學生對實驗的全局觀念及解決實際問題的能力[1-2]。

2 實驗材料與儀器

山東省濱州市鹽堿地秸稈還田處地塊土壤及秸稈。高壓滅菌鍋、pH計、超凈工作臺、培養皿、試管。

3 實驗設計與步驟

3.1 培養基配置。

羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)降解菌篩選培養基：酵母膏 0.1%，蛋白胨 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO4 0.1%，NH4NO30.1%，CMC-Na 1.5%、瓊脂粉 1.5%，pH 7.5。

剛果紅染色液：1 mg/mL

生理鹽水：氯化鈉0.9%

3.2 樣品采集

從山東省濱州市沾化區選取已秸稈還田地塊，選擇腐解程度中等的玉米秸稈與其表層土壤，裝入無菌自封袋，封口帶回。

3.3 土壤稀釋液制備

稱取土壤與秸稈混合物10 g，放入盛有90 mL無菌水的三角瓶中，加入滅菌后的玻璃珠，30℃ 180 r/min振蕩30 min，即為10倍稀釋土壤懸浮液。在超凈臺中取該稀釋液，進行10倍梯度稀釋，最終稀釋至10-6。

3.4 平板制備

取已滅菌CMC-Na篩選培養基，在超凈臺中分別倒入無菌平板中，每個平板約20 mL，每組4個平板，做好標記，自然凝固備用。

3.5 涂布分離及純化

分別吸取不同梯度的稀釋液置于平板上，使用灼燒滅菌冷卻后的涂布棒涂布均勻，使平板表明無明顯水跡即可，標記稀釋濃度與涂布時間等信息。30℃倒置培養，直至長出菌落。單菌落長出后，使用灼燒滅菌冷卻后的接種環，挑取單菌落進行平板劃線，置于30℃倒置培養，直至長出單菌落。

3.6 CMC-Na降解能力測定

將劃線純化后的單菌落點接種至CMC-Na平板上，30℃倒置培養7 d，在長出菌落的培養基上覆蓋配置好的剛果紅染色液，染色15 min，倒出染液，加入氯化鈉溶液洗滌多余的染液，重復一次，觀察菌落周圍是否出現透明圈。

4 實驗結果與分析

培養基中的纖維素可以與剛果紅染液形成紅色復合物，當纖維素分解菌在以纖維素為唯一碳源的培養基上生長時，則會形成以纖維素分解菌為中心的無纖維素圈，無纖維素圈在剛果紅染液染色后則表現為透明圈，通過是否產生透明圈來篩選纖維素分解菌。如圖1與表1所示，具有CMC-Na降解能力的菌株，可以在菌落周圍產生透明圈，透明圈的大小與菌株降解能力直接相關，透明圈越大，降解能力越強。

圖1 剛果紅染色后的纖維素降解菌

表1 纖維素降解菌數據統計

5 實驗設計反思

(1)選擇鹽堿地中秸稈還田地塊，有針對性的篩選具有抗鹽堿脅迫的纖維素降解菌，有助于將實驗理論與鹽堿地改良的實際問題聯系起來，使學生對實驗設計、實驗操作與結果分析過程理解更加透徹。實驗設計時長為6學時，纖維素降解菌在平板上的生長周期約7天，可以在三個周次的實驗中完成該綜合性實驗。

(2)土壤微生物種類豐富，我們可以根據不同實驗目的，選擇不同類型的土壤樣本，有針對性的篩選功能微生物，本實驗目標明確，針對鹽堿地秸稈還田中存在秸稈腐解中存在的問題設計并實施實驗，有利于培養學生針對具體實際問題開展科學實驗設計與研究的能力[3]。

(3)學生針對本實驗進行了相關的資料收集、方案設計、實驗準備等相關工作，在預習過程中，針對學生遇見的問題，老師進行講解。實驗結束后，讓學生對遇見的問題進行分析，并總結出詳細解答方案，并進行全班討論。這一綜合性實驗，使學生初步具備了資料收集、實驗方案設計、實驗方案實施、結果分析及解決實際問題的能力，訓練了科學的思維方式，有助于應用型人才的培養[4]。