骨形態發生蛋白2濃度對兔骨髓間充質干細胞生長的影響 *

陳銳棋 黃思聰

1 廣州醫科大學附屬第一醫院輸血科，廣東省廣州市 510120； 2 廣州醫科大學附屬第二醫院檢驗科

骨髓間充質干細胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是組織工程較為理想的種子細胞，具有自我更新和增殖能力，能向成骨細胞、軟骨細胞等分化[1]。骨形態發生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP)可通過誘導間充質骨祖細胞分化，促進成骨細胞成熟和功能，是促進骨和軟骨恢復的重要分子[2]，其中BMP-2是最有效的骨生長因子，能有效促進BMSCs向成骨細胞分化[3]。然而，BMP-2存在半衰期短、臨床所需劑量大、高成本等缺點，而且大劑量使用BMP-2會誘發炎癥反應，對骨組織的修復得不償失[4]。因此BMP-2的使用濃度目前是其臨床使用的一個重要討論方向。本研究希望通過探討BMP-2濃度對兔BMSCs(rBMSCs)生長及分化的作用并初步分析其可能的通路機制，了解BMP-2對BMSCs的生長規律的影響，旨在為臨床更好地利用BMSCs提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 BMP-2(PeproTech公司)，rBMSCs(廣州呼吸研究所制備與鑒定)；10%胎牛血清的MEM、0.25% 胰蛋白酶、1×磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Gibco公司。細胞計數儀(Beckman)，倒置相差顯微鏡(Leica)、細胞培養箱(Forma)及超凈工作臺(ESCO)。

1.2 rBMSCs復蘇、傳代、培養 從液氮凍存瓶中取出rBMSCs凍存管復蘇至已含5ml 10%MEM培養液的T25中，37℃、5%CO2培養。待T25里的細胞長至85%時(約6d)，0.25%胰蛋白酶消化細胞，傳代至T75中培養。待T75里的細胞長至85%時(約6d)，傳代至3個T75，繼續培養細胞長至85%，1×PBS洗細胞后用0.25%胰蛋白酶消化細胞，10%MEM培養液將細胞濃度調為約1×104，向4×24孔板中每孔加入0.5ml細胞工作液，37℃、5%CO2繼續培養。

1.3 BMP-2共培養 待步驟1.2細胞完全貼壁后(約24h)，其中3塊24孔板的各孔中分別加入終濃度為100ng/ml，50ng/ml、10ng/ml的BMP-2工作液。10%MEM為對照組。每4d換液1次共12d。

1.4 細胞形態觀察及細胞計數 每天用倒置相差顯微鏡觀察步驟1.3過程中細胞的形態特征，并用0.25% 胰蛋白酶消化細胞，細胞計數儀4塊24孔板中的其中兩個孔進行細胞計數。以細胞培養時間為橫坐標，細胞數量為縱坐標繪制兔骨髓間充質干細胞的生長曲線。

1.5 Notch通路相關分子檢測 提取及檢測試劑盒均購自天根公司，按操作說明檢測第6天及第12天步驟1.3處理過程中各組細胞Notch1/Jagged1/Hes1(見表1)表達水平，以β-actin為內參，結果以2-△△Ct表示。

表1 Notch通路相關分子引物

1.6 統計學方法 統計結果以均數±標準差表示，采用Graphpad-Prism-6進行統計分析，生長曲線比較采用多個樣本比較的秩和檢驗方法，細胞組間數目和基因表達比較采用ANOVA分析進行結果統計分析，P<0.05認為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 BMP-2濃度對rBMSCs細胞增殖的影響 4組rBMSCs的生長曲線(圖1)顯示，前6d是指數增生期，第6天細胞的增殖生長出現退化現象，從第9天開始就逐漸進入平臺期。多樣本秩和檢驗分析結果顯示，100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml 3個梯度濃度的BMP-2共培養的rBMSCS生長規律與對照組無明顯差別(P=0.729)。培養過程中第6、12天各組細胞量無明顯差異(P=0.625)。

2.2 BMP-2濃度對rBMSCs生長形態的影響 如圖2所示：第6天，對照組細胞基本保持長梭形，聚集生長現象不明顯。100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml 3個濃度實驗組的細胞形態逐漸由長梭形向多角形、不規則形轉化，同時聚集生長現象明顯加強。第12天，3個濃度實驗組的細胞形態呈多樣性，聚集生長明顯，但組間形態無明顯差異；而對照組細胞依然沒有呈現出聚集生長現象。

2.3 BMP-2濃度對rBMSCs生長過程中Notch通路相關分子表達的影響 Real-time PCR結果(圖3)顯示，第6天，與對照組細胞相比，100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml 3個濃度實驗組細胞的Notch1/Jagged1/Hes1表達均明顯上升，實驗組間無明顯差異(P>0.05)。到第12天，實驗組細胞各個基因表達均比第6天有不同程度的增加(P<0.05)，且依然高于培養同樣天數的對照組細胞；對照組細胞第6天與第12天比較，Notch1/Jagged1/Hes1表達無明顯改變(P>0.05)。

3 討論

隨著精準醫療的到來，各國越來越重視個體化治療的發展和應用，隨著資金的注入和研發水平的提高，細胞治療也逐漸成為個體化治療的主要手段。干細胞治療手段在細胞治療中是目前世界各國爭相研究并取得重大進展的領域[1]，其中在神經系統疾病和骨缺損修復等方面的成功尤為突出[2,5]。骨缺損治療一直是臨床骨科醫師所面臨的難題，雖然機體本身有創面修復機制，但較大的創面缺損不能自行愈合。骨移植是治療大骨缺損的常用方法，但自體移植存在供區骨供應有限、手術風險增加、手術時間延長等因素，異體植骨則可能會引起機體排斥反應、疾病傳播、骨不連等并發癥，嚴重限制了骨移植的臨床應用[6]。干細胞治療手段則為上述難題提供了新的治療突破口，間充質干細胞(MSC)屬于多能細胞，在早期發育中來自中胚層和外胚層[7]。首先在骨髓中發現，即骨髓間充質干細胞(BMSC)，它不僅具有胚胎干細胞的分化功能，而且可以在體外大規模復制、培養和低溫保存[8]，被認為是骨組織工程的種子細胞。BMSCs可生成包括成骨細胞在內的多種細胞，并在實現和維持適當的骨量方面發揮關鍵作用[9-10]。

人骨形態發生蛋 白-2(BMP-2)是一種強大的骨誘導蛋白，可以招募不同組織來源的MSCs并誘導為成骨細胞[11]；2002年獲得了美國FDA的批準，作為骨移植替代品用于脊柱融合和開放性脛骨骨折等[12]。BMP-2半衰期短，雖然高劑量的BMP-2可以產生良好的骨形成量，但也誘導了過度的炎癥反應且導致并發癥(包括：骨質量惡化、脂肪組織形成等)發生率顯著增加[13]，對骨損傷的修復得不償失。因此，高劑量BMP-2的有效性仍然是一個臨床關注的重要問題[4]。本次研究使用了100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml 3個梯度濃度的BMP-2共培養rBMSCs，以無添加BMP-2的rBMSCS為對照組進行比較，發現3種濃度的BMP-2與對照組的細胞增殖生長曲線的規律基本相同，提示在文中采用的濃度范圍內，BMP-2對rBMSCs的增殖促進能力并不明顯，需要提升rBMSCs的增殖效率可能需要更高濃度的BMP-2。而在BMP-2加入后，細胞形態的觀察發現rBMSCs分化趨勢增強，同時聚集生長現象更明顯，表明BMP-2對rBMSCs向功能細胞分化還是具有強大的促進作用，但結果顯示BMP-2濃度對rBMSCs生長形態的影響不大。

Notch信號通路參與調節細胞生長、細胞死亡和分化程序[14]。靶細胞上的Notch受體(Notch1-4)通過配體Jagged(Jag1、Jag2) 與鄰近細胞結合而被激活，Hes1則是典型Notch信號通路的下游靶基因[15]。本次實驗結果顯示BMP-2的加入能有效活化rBMSCs的Notch通路，該通路的相關靶基因Notch1/ Jagged1/Hes1表達均有不同程度的上升，但同樣的，BMP-2濃度的改變并無引起Notch通路活化程度的差異，從Notch1/Jagged1/Hes1表達的變化可以看出，Notch通路的活化程度與rBMSCs生長分化趨勢相吻合。有研究報道在成骨細胞不同分化階段有條件地過表達Notch證實Notch通路的激活能有助BMSCs早期分化，促進骨愈合[16]。結合本次結果，我們推測BMP-2對rBMSCs生長形態的影響可能通過Notch通路實現，但并無濃度依賴性。而Inzana研究則發現Notch通路活化及加速骨形成的程度與BMSCs的減少量一致[17]，暗示Notch可能對BMSCs增殖的促進作用有限，一定程度上給結果2.1提供了合理的解釋。

綜上所述，BMP-2可能通過Notch通路促進rBMSCs的分化，但沒有濃度依賴。提示如果保證BMSCs達到一定數量，較低濃度的BMP-2也可能達到有效促進BMSCs分化，幫助骨愈合的效果，同時有機會減低高劑量BMP-2帶來過度炎癥的風險。