調節性T細胞、自然殺傷細胞、T淋巴細胞亞群在白血病患兒中表達及意義

劉俊閃 王國鋒 郭明發

鄭州大學附屬兒童醫院 河南省兒童醫院，河南省鄭州市 450000

白血病是兒童期最常見的惡性腫瘤，約占全部兒童期癌癥的30%[1]；其發病機制目前尚未完全明確，研究者認為，抗腫瘤免疫功能抑制與白血病發生、發展、復發中明顯相關，其中細胞免疫發揮重要作用[2]。調節性T細胞、自然殺傷細胞、T淋巴細胞亞群是細胞免疫的重要組成部分[3]，因此，明確白血病患者調節性T細胞、自然殺傷細胞、T淋巴細胞亞群有望進一步了解疾病的發生機制，指導臨床診斷與治療。目前關于白血病患者體內免疫調節機制的研究較多[4]，但鮮有針對兒童白血病患者的研究報道。本研究檢測了白血病初發患兒及異體造血干細胞移植成功后患兒外周血中調節性T細胞、自然殺傷細胞、T淋巴細胞亞群的表達水平，為進一步探究白血病患兒體內免疫調節機制提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年6月—2018年6月間本院收治的白血病患兒84例。將其中初診白血病患兒72例歸為初診組；異體造血干細胞移植后來本院復查者12例歸為移植組。排除1個月內有激素、免疫抑制劑使用史的患兒；存在移植物抗宿主病的患兒。初診組中男40例，女32例；年齡3～12歲，平均年齡(7.18±1.30)歲。移植組中男7例，女5例；年齡3～11歲，平均年齡(6.95±1.17)歲。另取同期在本院體檢的健康兒童40名為正常對照組，其中男22例，女18例；年齡3～12歲，平均年齡(7.03±0.85)歲。三組兒童性別、年齡之間差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會審核批準，均在患兒以及患兒家屬知情下參與本次研究。

1.2 主要試劑與儀器 小鼠抗人單克隆抗體：APC標記CD8、CD4-PB、CD3/CD16+56/CD45、異硫氰酸熒光素標記CD4、CD25-PC5、藻紅蛋白標記CD127購于上海易匯生物科技有限公司；溶血素購于上海譜振生物科技有限公司。美國ACEA NovoCyteTM流式細胞儀，TDZ5-WS水平離心機，美國SI Vortex Genie 2 渦旋振蕩器。

1.3 標本制備與檢測 分別于初診組患兒入組時、移植組患兒移植成功后、正常對照組兒童體檢時，以及根據兒童急性淋巴細胞白血病診療建議(第四次修訂版)中的標準，采集初診組完全緩解患兒治療1個月后、3個月后，以及未緩解患兒的清晨空腹外周靜脈血3ml，加入EDTA抗凝管中，混合均勻，2 000r/min離心10min，收集血漿，取2支離心管，分別加入血漿100μl，編號試管1、試管2；向試管1中滴加10μl APC標記CD8、CD4-PB、CD3/CD16+56/CD45；試管2中滴加10μl異硫氰酸熒光素標記CD4、CD25-PC5、藻紅蛋白標記CD127，混勻后避光靜置20min，2支離心管中分別加入1ml溶血素，避光靜置20min，2 000r/min離心10min，棄去上清，分別加入500μl磷酸緩沖液，混勻后上流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 初診白血病患兒治療情況 72例初診白血病患兒中，完全緩解47例(65.27%)、部分緩解9例(12.50%)、未緩解9例(12.50%)，死亡或放棄治療7例(9.72%)。

2.2 外周血調節性T細胞、自然殺傷細胞水平分析 與正常對照組相比，初診組患兒入組時、完全緩解后1個月、未緩解者治療后的外周血調節性T細胞水平明顯升高，自然殺傷細胞明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；完全緩解后3個月、移植成功后的調節性T細胞、自然殺傷細胞與正常對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組外周血調節性T細胞、自然殺傷細胞水平比較

2.3 外周血T淋巴細胞亞群水平分析 與正常對照組相比，初診組患兒入組時、未緩解者治療后外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平明顯降低，移植組患兒移植成功后CD4+、CD4+/CD8+水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；完全緩解后1個月、完全緩解后3個月的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平與正常對照組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組外周血T淋巴細胞亞群水平比較

3 討論

近年來隨著白血病治療技術的快速發展，兒童白血病的治愈率明顯提升[5]。但白血病發病機制尚未完全明確，仍有部分患兒因病情復發而死亡。目前研究認為，體內免疫系統功能異常，特別是抗腫瘤功能被抑制，在白血病發生、發展、復發中發揮重要作用[6]。調節性T細胞在免疫系統中的作用受到廣泛關注[7]；研究者發現，調節性T細胞在自身免疫性疾病、感染性疾病、移植耐受中發揮作用的同時與腫瘤的發生、發展密切相關[8]。基礎理論上，調節性T細胞參與體內白血病細胞的免疫反應，當化療后體內白細胞數量明顯下降后，調節性T細胞的作用更為重要[9]；本文中治療效果不佳的白血病患兒外周血調節性T細胞水平明顯高于正常對照組，提示患兒體內抗腫瘤免疫系統被明顯抑制。

自然殺傷細胞是體內感染后的首道防線，也是抗腫瘤免疫中最先活化的免疫細胞，發揮細胞毒性和免疫調節功能[10]。本文結果提示雖然白血病患兒病情緩解后體內免疫系統逐漸恢復，但自然殺傷細胞恢復速度較為緩慢。因此，白血病患兒臨床治療中應定期檢測外周血自然殺傷細胞水平，用于評估患兒病情復發風險。T淋巴細胞亞群包括能夠直接反映T淋巴細胞數量的CD3+，在多種免疫細胞功能提升中發揮重要作用的CD4+，以及CD4+的調節性免疫抑制因子CD8+[11]。本文顯示，白血病患兒入組時、未緩解者治療后的T淋巴細胞水平明顯低于正常對照組，提示患兒體內細胞免疫功能被抑制。經有效治療后，病情完全緩解后1個月時T淋巴細胞亞群恢復至正常水平，反映白血病患兒細胞免疫功能得到有效恢復。本文中移植成功后的患兒CD4+、CD4+/CD8+水平仍明顯低于正常對照組，可能與移植后對抗體內免疫排斥，需服用大量免疫抑制劑或激素，對機體免疫系統的重新建立造成不良影響，在停藥后可逐漸恢復；臨床中應嚴密監控白血病患兒異體造血干細胞移植后的細胞免疫重建，避免出現體內免疫損傷。