新疆葉爾羌河流域斑重唇魚寄生單式指環蟲中國一新紀錄

容夢婕，喀迪爾丁·艾爾肯，張文潤，郝翠蘭，穆妮熱·喀迪爾，田勝利，岳 城

(新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052)

葉爾羌河位于新疆西南部，發源于喀喇昆侖山脈北麓，是我國最大的內陸河—塔里木河的重要源流之一。該河的發育形成、地理地貌特點以及上游水系的特殊自然環境，使得該河孕育有一些特殊的土著魚類資源，包括裂腹魚亞科(Schizothoracinae)及鰍科高原鰍屬(Triplophysa)[1]魚類。斑重唇魚(Diptychusmaculates)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)裂腹魚亞科，在我國主要分布于新疆天山以南的塔里木河水系和天山以北的伊犁河流域各水系[2-3]。近年來，由于人為因素的干擾，斑重唇魚的分布區域正在逐漸縮小，種群數量逐漸下降，現已被列為新疆維吾爾自治區II級水生野生保護動物[4]。為了保護斑重唇魚類資源，牛建功等[5]研究了斑重唇魚在人工條件下馴化養殖、繁育和增殖放流等技術，以達到物種保護、生態修復和恢復種群數量的效果。此外，相關學者對該流域斑重唇魚的研究多集中于野外資源調查和種群進化等研究[6-9]，對危害其種群健康的寄生蟲病原報道較少。

指環蟲(Dactylogyrus)是單殖吸蟲種類中最為豐富的一個類群，其宿主種類多達28科194屬，主要寄生于鯉科魚類的鰓部[10]，表現出極強的宿主特異性。目前，由于仍有許多鯉科魚類尚未進行全面調查，有學者認為還存在大量的指環蟲新種有待發現、命名和描述[11]。據報道，寄生于裂腹魚亞科魚類的指環蟲全球約有16種[12-13]，在我國被記錄的有8種指環蟲，其中寄生于斑重唇的指環蟲僅有一種，為喀迪爾丁等[14]在新疆伊犁河流域采集的重唇魚指環蟲(Dactylogyrusdiptychus)。本課題組于2019年5月-2020年7月進行葉爾羌河魚類寄生蟲區系調查時，在斑重唇魚鰓部采獲1種指環蟲，與伊犁河流域發現的重唇魚指環蟲存在較大形態差異。經資料檢索該種在我國未見報道，本研究通過傳統形態學和分子生物學方法鑒定，明確該指環蟲種類，豐富葉爾羌河魚類寄生蟲病原體的種類組成，補充我國單殖吸蟲名錄，同時補充該指環蟲的分子數據，為該蟲在分子系統進化方面積累資料。

1 材料與方法

1.1 樣品的來源與處理

2019年5月-2020年7月在葉爾羌河流域的塔什庫爾干河段(37°46′ N，75°13′ E)共采集斑重唇魚272尾。對新鮮的魚類標本進行拍照、編號、稱重和測量，并記錄相關數據。魚類解剖及寄生蟲采集主要參照《魚病調查手冊》[15]。將宿主鰓片逐一取下后，滴加少量生理鹽水置載玻片上，用解剖針輕輕刮取粘液，并在解剖鏡下逐一檢查，挑取蟲體。發現蟲體后將其吸取到盛有清水的小皿中，沖洗干凈，置于1.5 mL的EP管中，滴加75%和95%濃度的酒精固定。

1.2 形態學鑒定

在解剖鏡下挑取形態完整的12只蟲體逐一放置在載玻片上，用4% PVL(聚乙烯醇-乳酸酚染液)固定封片。在光學顯微鏡(Nikon E2000)下觀察，通過EZ-MET軟件測量后吸器及交接器中的幾丁質結構。利用t檢驗比較測量結果平均數的差異是否顯著。測量拍照后在硫酸紙上繪制特征圖，并依據文獻[12，13]進行形態學鑒定。所制蟲體標本保存在新疆農業大學動物醫學學院寄生蟲教研室。

1.3 DNA提取、擴增及測序

取95%乙醇固定的蟲體樣本置于TE Buffer(pH 8.0)中浸泡過夜后，將蟲體分別裝入1.5 mL的EP管中，用Trans Gen動物組織基因組DNA提取試劑盒提取蟲體DNA(具體操作方法依照試劑盒說明書)。

選取18S-ITS1-5.8S rDNA序列作為目的序列，擴增引物分別參照imková等[16]，上游引物S1：5′-ATTCCGATAACGAACGAGACT-3′，下游引物IR8：5′-GCTAGCTGCGTTCTTCATCGA-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系總體積為25 μL：2 × Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，1 pmol/μL上下游引物各1 μL，10 ng/μL的模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。同時，以雙蒸水代替模板DNA作為陰性對照。優化選取的反應條件：95 ℃預變性4 min，92 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，35個循環，最后在72 ℃延伸10 min。

取5 μL PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余20 μL PCR產物跑膠后，切取目的條帶，并用Trans Gen Biotech(全氏金)膠回收試劑盒進行純化。純化產物連接到pMD18-T載體上，再轉入大腸桿菌(E.coli) DH5α感受態細胞中，LB平板培養，經PCR檢測后每個樣品選取2個陽性克隆送至上海生工進行測序。

1.4 序列比對及系統發育樹構建

測序結果用 SeqMan 軟件進行校對和編輯，在DNAMAN 7.0軟件中進行序列比對，計算序列間的差異百分比。基于Kimura雙參數模型，采用MEGA 7.0和BLAST計算所測序列之間的A、T、G、C的平均含量、堿基變異位點、簡約信息位點等信息，并計算遺傳距離。從GenBank數據庫中選取與所得序列相似度較高的20種指環蟲18S-ITS1-5.8S rDNA序列，以幾丁嗜麗魚蟲(Cichlidogyrussclerosus)為外類群，一起導入 Phylosuite[17]軟件中，進行貝葉斯法(Bayesian Inference，BI)建樹和最大似然法(Maximum Likelihood，ML)建樹。運用Model Finder進行模型計算，以AIC為標準篩選出ML樹和BI樹的最佳替換模型分別為TIM3+F+I+G4和GTR+F+I+G4。用 PhyloSuite 中自帶的IQ tree和Mr Bayes軟件建立ML和BI系統發育樹。其中BI樹共運算6 000 000代蒙特卡羅模擬(Markov chain Monte Crlo；MCMC)，每100代取樣1次，共進行兩次重復，用后驗概率來表示各節點的置信度。利用IQ tree 2版本[18]中的近似無偏檢驗(AU檢驗)ML和BI方法構建的系統發育樹的拓撲構形差異是否具有統計顯著性。

2 結果

對272尾斑重唇魚進行剖檢，共收集蟲體2 995只。通過種類鑒定，結果發現斑重唇魚僅感染了一種指環蟲，總感染率為70.2%，平均感染強度為15.68 ± 1.88，最高感染強度為189。

2.1 蟲體的形態學特征

基于12個封片標本，蟲體呈柳葉狀，為小型單殖吸蟲，體長394(308 ～ 471) μm，體最大寬89(79 ～ 103) μm。眼點兩對，咽近乎呈圓形，大小48(39 ～ 58) μm× 49(40 ～ 58) μm。后吸器位于體后端，類橢圓形，長69(64 ～ 76) μm，寬103(94 ～ 126) μm，包含1對中央大鉤、1個聯結片、7對邊緣小鉤。邊緣小鉤發育良好，可明顯區分鉤尖、鉤柄和柄軸3部分，其中柄軸短而粗壯。7對幾乎等大，全長23(19 ～ 24) μm，鉤尖長5(4 ～ 6) μm，鉤柄長8(7 ～ 9) μm，柄軸長9(7 ～ 10) μm。中央大鉤基部較短，有長而彎曲的鉤尖，全長61(56 ～ 68) μm，基部長40(37 ～ 45) μm，鉤尖長25(22 ～ 28) μm，內外突明顯分葉，且內突遠遠大于外突，長26(23 ～ 28) μm，外突長2(1 ～ 3) μm。聯結片呈粗壯“一”字型，兩端向上微翹且圓鈍，中央略“凸”，大小4(3 ～ 5) μm× 43(40 ～ 48) μm。

交接器由交接管和支持器組成，交接管呈現出明顯的中空管狀結構，基部膨大，并被形似“煙斗”狀的基質包裹，逐漸延伸膨大，末端形成喇叭狀，管長42(38 ～ 45) μm。支持器與交接管基部相連，其結構如同俄文字母“Г”，末端呈指狀彎曲并附著一個弧形突起，支持器長38(37 ～ 42) μm。陰道和卵未見。

圖1 單式指環蟲整蟲(A)；后吸器(B、D)；交接器(C、E)Fig.1 Total view of Dactylogyrus simplex (A)；Haptor (B and D)；Copulatory organ (C and E) A、B、C：顯微結構圖；D、E：手繪圖，比例尺=10 μm

2.2 蟲體的分子鑒定及系統發育分析

擴增獲得的指環蟲rDNA片段進行校正后，最終長度為951 bp，包含18S和5.8S的部分序列(長度分別為514 bp和27 bp)以及ITS1區域的完整序列(長度為410 bp)。其中保守位點499個，變異位點515個，簡約信息位點438個，以及73個自裔位點。A、T、G、C堿基的平均含量為23.5%、27.8%、26.5%、22.2%，A+T的含量高于G+C的含量。選取2個蟲體的18S-ITS1-5.8S rDNA 序列(兩序列的一致性為100%)，上傳至GenBank數據庫，登錄號為MT476980-MT476981。

ML法和BI法構建的系統發育樹經AU檢驗后發現無顯著性差異(P>0.05)。因而，選取BI樹(同時標注ML分析的分支支持率)作為代表，用來說明系統發育關系(圖2)。系統發育樹分為兩個大的進化支，其中斑重唇魚上的重唇魚指環蟲與隱藏指環蟲(D.cryptomeres)、具鱗指環蟲(D.squameus)和頁形指環蟲(D.lamellatus)親緣關系較近，聚為穩定的獨立分支。而單式指環蟲與鯽寄生的美麗指環蟲(D.formosus)、錨鉤指環蟲(D.anchoratus)及弧形指環蟲組成的分枝互為姊妹枝，且位于另一分支上。

圖2 基于 18S-ITS1-5.8S rDNA 序列構建的鯉科魚類寄生指環蟲貝葉斯法(BI)系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Dactylogyrus based on 18S-ITS1-5.8S rDNA sequences based on the Bayesian Inferences (BI) method分支節點數值分別表示BI和ML的分支自展檢驗支持率

3 討論

我國指環蟲種類多樣，約占世界的40%，這與指環蟲強烈的宿主特異性密切相關[19]。通常情況下，指環蟲可以根據宿主種類，進行初步的鑒定。經文獻查閱，寄生于斑重唇魚的指環蟲有3種，分別為單式指環蟲(D.simplex)、D.drjagini和重唇魚指環蟲(D.diptychus)[12,14]，故將葉爾羌河斑重唇魚鰓上檢獲的指環蟲與這3種指環蟲進行了形態及測量值的比較。

本種與D.drjagini和重唇魚指環蟲進行形態學特征比較時發現，不管是在交接器還是后吸器的形態上都明顯存在不同(圖3)，主要體現在：本種中央大鉤內外突明顯分葉，且內突遠遠大于外突，鉤尖較長，而重唇魚指環蟲中央大鉤內外突分葉不明顯，D.drjagini的雖明顯分葉，但內外突幾乎等大，且鉤尖較短；本種僅有一聯結片，而重唇魚指環蟲和D.drjagini含有背、腹兩個聯結片；交接器的差異也尤為明顯。但本種與前蘇聯文獻記載的單式指環蟲[12]進行形態學特征比較后，發現兩者形態非常相似，僅交接管基部的形態以及聯結片中部有略微差別。兩者交接管基部的“漏斗狀”肌質的包裹狀態不太一樣，該形態的差異可能是由于蟲體的觀察角度不同[20]。本種的聯結片中部略微“凸”出，而先前文獻中單式指環蟲的聯結片呈“一”字，該結構的差異可能是因為發育和寄生蟲對宿主或局部環境的適應而發生的變化[21]。此外，對特征形態的測量值對比發現(表1)，兩者的測量值差異不顯著(P>0.05)。因此，從斑重唇魚鰓部采集的指環蟲為單式指環蟲，該種在我國尚未報道，為我國一新紀錄種。

圖3 重唇魚指環蟲(A)、D.drjagini(B)、單式指環蟲[前蘇聯(C)]、單式指環蟲[本研究(D)]幾丁質結構對比Fig.3 Comparison of the chitinous structure of Dactylogyrus diptychus (A),D.drjagini (B),D.simplex (C,former Soviet Union),D.simplex (D,the present study)a.中央大鉤，b.邊緣小鉤，c.背聯結片，d.腹聯結片，e.交接器A、B、C圖比例尺：20 μm；D圖比例尺：10 μm

表1 新紀錄種與斑重唇魚寄生指環蟲的形態特征比較Tab.1 Comparison of the morphological characteristics of the newly recorded species and the known Dactylogyrus of the D.maculates μm

傳統形態學一直作為鑒定和研究指環蟲的主要方法，但隨著科技的發展，形態學的局限性逐漸被人們所意識到，因而有學者開始探索研究指環蟲其它方法，以補充和完善傳統形態學的不足及其局限性[22]。Cunningham等[23]是將分子生物學方法應用于單殖吸蟲研究的首位學者。本研究基于18S-ITS1-5.8S rDNA序列構建的BI樹顯示，單式指環蟲與鯽屬魚類寄生的美麗指環蟲、錨鉤指環蟲及弧形指環蟲聚為一支，其親緣關系較近，而單式指環蟲與同種宿主上寄生的重唇魚指環蟲分別位于不同的兩支。該結果可能與地理隔離對宿主魚類的影響相關[24-25]。