腸道GLP-1受體表達水平與T2DM及肥胖的關系

孫加鳳 張 麗 黎宗保 裴 翔 劉 丹

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)作為最常見的內分泌代謝性疾病之一，已被證實除了與種族、遺傳、環境等有關以外，肥胖、不良生活習慣也是患病的重要因素[1]。近年來，隨著人口老齡化速度加快、人們生活壓力增加、運動及飲食習慣改變，T2DM的患病率不斷提高，且T2DM人群中肥胖率居高不下[2]。隨著臨床研究的不斷深入，發現腸道菌群、分泌細胞等與T2DM、肥胖等代謝性疾病均存在一定關聯[3]。胰高血糖素樣肽(glucagon-like peptide，GLP)-1是一種腸肽類激素，由腸道L細胞分泌，已被證實可抑制胃排空、減少腸蠕動，繼而有助于控制攝食及體質量[4]。同時，有研究[5]表明，GLP-1可通過調節腸促胰島素系統來穩定血糖。GLP-1現已成為T2DM藥物治療的作用靶點，例如已問世的GLP-1受體激動劑與類似物主要通過與其受體結合達到調控血糖的目的[6]。人體尤其是腸道GLP-1受體表達可能與T2DM及肥胖有一定關系，故擬前瞻性研究，從接受結腸外科手術的患者中抽取目標對象，收集其正常近端腸道病理切片，觀察GLP-1受體表達水平，并分析其與T2DM及肥胖的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年7月至2019年6月三亞中心醫院接受結腸外科手術的肥胖型T2DM、單純T2DM、體質量與血糖均正常的患者各30例分別為A組、B組、C組。納入標準：①A組、B組患者經口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT)診斷，滿足WHO發布的糖尿病診斷標準和分類[7]中T2DM標準；A組患者同時滿足肥胖標準，即體質指數(body mass index，BMI)≥28 kg/m2；②男女不限，年齡40～85歲；③于近端結腸(回盲部-結腸肝曲)部位行手術，獲得病理切片(包含正常腸組織)；④積極配合相關檢查，各項資料詳實。排除標準：①確診為糖耐量異常或1型糖尿病或處于高血糖高滲狀態；②合并高血壓、冠心病、慢性阻塞性肺疾病等慢性疾病或嚴重肝腎功能損害；③合并急性或重癥感染、嚴重營養不良、惡性腫瘤、甲狀旁腺功能異常及精神障礙；④既往有胃腸道、胰腺疾病史，胃腸手術史；⑤有外觀體形改變(如明顯駝背、脊柱畸形)；⑥處于妊娠或哺乳期。本研究通過了醫院倫理委員會審核，且所有患者均在充分獲知研究意義和目的前提下自愿簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 信息收集 收集所有患者的基本信息資料，如性別、年齡、身高、結腸外科手術原因、BMI、腰臀比(腰圍與臀圍的比值)、體脂率[(1.20×BMI)+(0.23×年齡)-(10.8×性別)-5.4，其中性別男為1，女為0]、吸煙情況、既往病史等。

1.2.2 生化指標檢測 禁食12 h后次日8時抽取靜脈血5 mL，靜置后按3 000 r/min離心處理(半徑=8 cm)15 min，取血清標本；以免疫化學發光法測定空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、空腹胰島素(fasting insulin，Fins)，以克隆抗體凝集反應法完成糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)測定，以放射免疫分析法測定C肽，測定服糖后2小時血糖(2 h plasma glucose，2hPG)水平；并以全自動生化分析儀測定總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)水平。

1.2.3 腸道GLP-1受體檢測 每例患者取6～8個病理切片，顯微鏡下明確包含正常結腸組織至少占80%以上，蠟塊進行4 μm切片。①免疫組化(SP法)：常規脫蠟入水，3%甲醇雙氧水處理，微波熱修復后PBS沖洗；切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min后滴加一抗(稀釋比例1∶100)，4℃過夜；滴加熒光標記的二抗(IgG)，避光37℃環境下培育20 min后PBS充分水洗，之后封片，觀察免疫組化圖像陽性物質著色情況。②免疫組織化學圖像采集與積分光密度測定：挑選3組患者對應的陽性、陰性組織相，均完成(200×)顯微照相，并將其轉換為灰度為8位的圖片(圖像于220～240間采集)，主要測量空白區域的灰度值，完成調試，并依次采集3組對應的圖像，借助Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，均隨機選取5個高倍視野(400×)測定其積分光密度，以平均密度值作為最終的腸道GLP-1受體蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 3組患者一般資料比較 3組患者性別、年齡、身高、吸煙史及結腸外科手術原因對比差異無統計學意義(P>0.05)；A組BMI、腰臀比、體脂率均高于B組、C組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組患者一般資料比較

2.2 3組患者生化指標水平比較 FBG、2 h PG、Fins、HbA1c、C肽比較，A組>B組>C組，差異均有統計學意義(P<0.05)；3組患者TC、TG比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組患者生化指標水平比較

2.3 3組患者腸道GLP-1受體表達情況比較 各組標本進行免疫熒光染色，通過熒光顯微鏡觀察標本的特異性熒光強度，顯示A組、B組、C組腸道GLP-1受體表達程度依次下降，見圖1；免疫組化檢測各組腸道GLP-1受體分布，顯示GLP-1受體高表達于近端結腸黏膜層，肌間神經層、環肌層中可見少量表達，且A組、B組、C組GLP-1受體表達依次升高，見圖2；高倍視野下積分光密度的測定各組腸道GLP-1受體蛋白的相對表達量，A組、B組、C組分別為(98.22±17.30)、(117.85±24.07)、(149.62±29.40)，依次升高，差異有統計學意義(F=34.738，P<0.05)。

圖1 3組結腸組織免疫熒光圖注：圖A、B、C分別為A組、B組、C組標本進行免疫熒光染色示例，圖中藍色為腸道黏膜細胞核，紅色為GLP-1受體表達

圖2 3組免疫組化染色圖(400×)注：A、B、C分別為A組、B組、C組免疫組化染色示例

2.4 腸道GLP-1受體相對表達量與各指標相關性分析 Pearson相關性分析顯示，腸道GLP-1受體相對表達量與BMI、腰臀比、體脂率、FBG、2 h PG、Fins、HbA1c、C肽呈負相關(r=-0.326,-0.338,-0.421,-0.625，-0.520，-0.471，-0.394，-0.362，P<0.05)。

2.5 影響腸道GLP-1受體相對表達量變化的多因素回歸分析 為進一步明確各因素對腸道GLP-1受體表達的影響作用，以腸道GLP-1受體相對表達量為因變量，以單因素分析有差異的指標為自變量(指標不賦值，按實際值分析)進行多元線性逐步回歸分析(引入標準為P<0.05，剔除標準為P>0.10)，得出BMI、腰臀比、體脂率、FBG、2hPG、Fins、HbA1c、C肽均為腸道GLP-1受體相對表達量變化的獨立影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 影響腸道GLP-1受體相對表達量變化的多因素回歸分析

3 討論

T2DM為世界范圍內排第3位(繼心腦血管疾病、腫瘤之后)的威脅人類健康的慢性非傳染性疾病，可誘發動脈粥樣硬化、腦梗死等大血管病變，糖尿病腎病、視網膜病變、神經病變等微血管病變，以及高血壓、脂肪肝、肝硬化、免疫異常、腫瘤、膽石癥、肥胖、高尿酸血癥、慢性骨關節炎等多器官損害或相關疾病，針對性防治T2DM已迫在眉睫。現階段普遍認為,肥胖型T2DM發病的高危因素有2個，一是代謝綜合征，其與T2DM具有胰島素抵抗、糖耐量異常等某些共同的發病環節；二是肥胖，超重和肥胖本身是T2DM的危險因素，尤其是腹型肥胖[8]。本研究中，A組除了BMI、腰臀比、體脂率顯著高于其余兩組以外，其FBG、2hPG、Fins、HbA1c、C肽水平也顯著高于其余兩組，表明肥胖型T2DM患者糖代謝紊亂較單純T2DM患者更嚴重，與國內外報道[9-10]一致。分析原因，肥胖患者的脂肪組織特別是內臟脂肪可分泌瘦素、脂聯素、游離脂肪酸等諸多活性信號分子，并各自通過不同的機制干擾胰島素信號傳導通路、誘導凋亡及下調胰島素受體底物基因表達等，繼而引起胰島素抵抗或β細胞功能障礙；且肥胖患者通常合并有內皮功能損傷，其與胰島素抵抗相互作用，共同促進，最終可增加T2DM風險[11]。

GLP-1一般受腸道內葡萄糖、脂肪酸、氨基酸等營養物質的刺激而分泌產生，受體廣泛分布于各個組織與系統，涵蓋胃腸、大腦、腎臟、胰腺、脂肪等，現今相關研究多集中于胰腺、心血管等領域，針對腸道表達的文獻不多。本研究免疫組化顯示，GLP-1受體高表達于近端結腸黏膜層，肌間神經層、環肌層中可見少量表達，且A組、B組、C組GLP-1受體表達依次升高，其相對表達量也依次升高，提示T2DM患者尤其是肥胖型T2DM患者腸道GLP-1受體表達明顯降低。楊雪等[12]的實驗發現，肥胖會顯著降低大鼠血清GLP-1表達；張偉等[13]的研究發現，初診T2DM伴腹型肥胖患者血清GLP-1水平顯著高于單純T2DM或其他肥胖類型T2DM患者，一定程度支持了本研究觀點。結合現有研究及GLP-的多種生理作用，分析T2DM及肥胖患者腸道GLP-1受體表達更低的可能原因[14-15]：①GLP-1受體作用于胰島β細胞，能發揮葡萄糖依賴性的刺激胰島素合成與分泌作用，促進β細胞增殖、分化、再生與修復，有效抑制胰高血糖素分泌，而T2DM或肥胖患者胰島β細胞受損明顯，可能與GLP-1受體分泌減少有關；②GLP-1受體促進胰島素敏感靶器官如肝臟、肌肉與脂肪組織攝取及充分利用葡萄糖，而T2DM或肥胖患者可能由于GLP-1受體表達降低而導致胰島素敏感靶器官此類生理功能異常；③GLP-1受體作用于胃腸道和大腦，可延緩胃排空、腸道蠕動，繼而增加飽腹感、控制食欲并減少攝食，故而實現降糖及減輕體質量。GLP-1受體分泌異常減少時可能導致降糖及減重相對更困難。但上述機制仍有待進一步證實。曹昺焱等[16]的動物實驗發現，T2DM大鼠胰島形態與GLP-1受體有關，經針刺干預后胰島形態、GLP-1受體表達有所改善。同時，近年來GLP-1及其類似物已被證實可通過多種途徑實現降低BMI、體脂率及糾正糖耐量異常的作用[17]。需指出的是，天然GLP-1因半衰期極短，在體內僅僅需要1～2 min即可降解并失去其對應生物效應，若依賴于GLP-1降糖往往需持續輸注才能確保發揮效應有效濃度，明顯不太符合臨床實際。事實上，已上市的利拉魯肽等GLP-1類似物彌補了這一不足，在人體內GLP-1及其類似物主要經過結合其特異性GLP-1受體發揮作用，故GLP-1受體被認為是GLP-1及其類似物治療T2DM的重要作用靶點[18]。

本研究進一步分析發現，腸道GLP-1受體相對表達量與BMI、腰臀比、體脂率及FBG、2hPG、Fins、HbA1c、C肽呈負相關，且上述肥胖指標及糖代謝指標均為影響腸道GLP-1受體相對表達量變化的危險因素，由此證實腸道GLP-1受體表達與T2DM、肥胖有關，有望為T2DM、肥胖的早期預防措施的制定提供一定依據，但其價值需后期進一步論證。本研究不足之處在于樣本量較小，且為獲得腸道病理切片，納入患者均接受結腸外科手術，無法肯定手術完全不會影響生化指標檢測結果，因此相關結論仍需擴大樣本量、更嚴謹的研究論證。