基于“熱證可灸”理論研究艾灸對胃熱證大鼠道微生態的影響*

余云進，謝宇鋒△，楊錦蘭，楊宗保，馮 軍，沈佳成

(1. 廣州中醫藥大學深圳醫院(福田)，廣東 深圳 518000；2. 廈門大學醫學院，福建 廈門 361102)

胃熱證是由于過食辛辣或飲酒過度等因素，致使熱邪壅胃、阻滯氣機、損傷胃絡，主要表現為胃脘灼痛的中醫證候。相關研究表明，胃黏膜的炎性病變是胃熱證大鼠病理學的主要表現[1]。而長期高頻率食用辛辣食物及飲酒等，會損傷胃黏膜并誘發胃炎[2]。因而，胃熱證與胃黏膜損傷及相關的炎性疾病具有較大相關性。艾灸作為中醫的特色療法之一，具有操作簡便的特點，對疾病的防治和保健具有重要作用。艾灸胃經穴能減輕大鼠的胃黏膜損傷[3]，通過改善機體的抗炎及免疫作用治療熱證[4]。

近年來，腸道微生物組成的改變被認為是疾病發生發展的原因之一。腸道微生物群的分部組成在胃部健康和疾病方面發揮著重要作用[5]。本研究擬通過16S rDNA測序方法分析胃熱證大鼠及艾灸胃經穴治療后腸道菌群的組成變化，利用Illumina Hiseq高通量測序技術分析腸道菌群結構，通過比較艾灸胃經穴對胃熱證大鼠腸道微生態的影響，探討“熱證可灸”的腸道微生態調節作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級雄性SD大鼠24只，6周齡，體質量(150±20)g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號SCXK(滬)2012-0002。按隨機數字表法將大鼠分為空白組、模型組、胃經穴組、對照點組各6只，在廈門大學實驗動物中心飼養，飼養環境SPF級，于實驗前適應環境1周，控制室溫20～22 ℃，相對濕度65%～70%，自然光暗周期，自由攝食飲水。本實驗已通過廈門大學實驗倫理委員會審查。

1.2 主要試劑與儀器

艾灸粒(250 g/粒，225粒/盒，南陽仙草藥業有限公司)；無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，純度為分析純度，批號20170418)；純辣椒粉(廈門市陳有香調味品有限公司同安分公司)；高效細胞裂解液(碧云天生物技術，批號P0013B)；牛血清白蛋白(碧云天生物技術，批號ST023)；神經降壓素(Neurotensin,NT)一抗、二抗(上海圣克魯斯生物技術公司，批號sc-20806)；超敏ECL化學發光試劑盒(碧云天生物技術，批號P0018)；石蠟切片機(RMB235，德國萊卡Leica公司)，顯影系統Tanon 5200 s(上海天能科技有限公司)；智能生物顯微鏡(BX53，奧林巴斯Olympus公司)；勻漿機IKA T10 basic(德國IKA公司)；低溫高速離心機centrifuge 5418R(Eppendorf 中國有限公司)；電泳系統Mini-RPOTEAN Tetra System(美國BIO-RAD公司)；酶標儀M200 PRO(瑞士TECAN集團公司)。

1.3 模型制備

模型制備參照Zou ZJ等[6]方法，將辣椒干粉80 g混合于1 L蒸餾水中，經120目篩過濾后制備出辣椒混懸液(80 mg/ml)。空白組灌胃1 ml生理鹽水，每日2次，連續7 d。模型組、胃經穴組和對照點組大鼠以10 ml/kg辣椒混懸液灌胃，每日2次，連續6 d。第6天灌胃后大鼠禁食不禁水12 h，于第7天灌胃無水乙醇(1 mL)1次。造模12 h后斷頭處死預實驗大鼠，取出全胃并剪開觀察胃黏膜情況，可見胃竇、胃體胃黏膜出現充血、水腫狀態，病理形態學檢測可見黏膜損傷、炎性浸潤等，提示模型復制成功。

1.4 干預方法

1.4.1 選穴方法 根據課題組前期研究艾灸干預胃黏膜損傷機制,胃經穴組選取足陽明經梁門、足三里為治療穴位[7]，穴位定位參照李忠仁《實驗針灸學》[8]；大鼠梁門穴位于腹部正中線與乳頭線之間的中點，臍上約 20 mm；大鼠足三里穴位于膝關節后外側，腓骨小頭下約 5 mm 處。對照點組分別選取梁門穴外下側2 cm脅肋部、小腿內側與足三里同水平部位為艾灸干預對照點，以苦味酸標記所選穴位或對照點。

1.4.2 艾灸方法 造模結束后第2天開始干預。將胃經穴組、對照點組大鼠仰臥并用木板捆綁固定，穴位或對照點處的毛發脫毛，然后將動物特用艾灸粒固定在灸架上，在離干預穴區2 cm處艾灸，艾灸距離隨艾灸時間的增加逐漸調整至離干預穴位點2～3 cm處，以防燙傷大鼠，每日1次，每次20 min，連續7 d，每次艾灸取單側穴位，兩側交替使用。空白組大鼠和模型組大鼠同樣捆綁固定，不做干預。

1.5 標本采集

所有組別大鼠在艾灸干預結束后，抓取大鼠刺激其排便，用無菌EP管接取糞便，立即放入液氮中急凍保存，取樣結束后移入-80 ℃冰箱。然后將所有大鼠斷頭處死解剖取胃，沿胃大彎剪開并用生理鹽水沖洗，肉眼觀察胃黏膜情況，將胃竇部胃黏膜分成兩份，一份放入10%的甲醛溶液中固定24～48 h,石蠟包埋切片進行HE染色。另一份胃黏膜組織迅速放入液氮凍存1 h后移入-80 ℃冰箱，進行Western blot檢測。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 胃黏膜組織病理形態學光鏡檢測 胃黏膜組織固定后，梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋，二甲苯透明、切片，HE染色后光鏡下觀察胃黏膜組織病理改變并收集圖片。

1.6.2 Western Blot法檢測胃黏膜神經降壓素蛋白表達 將大鼠胃黏膜組織切碎，參照碧云天公司RIPA裂解液方法裂解組織細胞，進行勻漿、裂解、蛋白提取、濃度定量、配制溶液、配膠。取20 μg總蛋白進行電泳、轉膜。于封閉液 (5%脫脂奶粉) 中室溫封閉2 h,一抗 (1∶1000)搖床慢速, 4 ℃孵育過夜，然后TBST洗滌3次，加二抗(1∶10000)室溫下孵育1 h，結束后用TBST洗3次，搖床140 r，每次5～10 min。配置ECL試劑盒讀取條帶顯影拍照，雜交信號使用Image J(Nathional Institutesof Health, USA)軟件進行灰度值測定。

1.6.3 腸道微生態檢測 對所有大鼠糞便采用Qiagen的PowerFecal DNA提取試劑進行糞便總DNA提取，用 16S V3-V4特異引物對 DNA 樣品進行 PCR 擴增,采用 Illumina HiSeq 2500平臺2×250 bp的paired-end 數據測序，通過拼接得到較長序列進行16S分析，結束后對原始數據進行整理、過濾及質量評估，然后進行OTUs列表生成。測序完成后，用FLASH軟件(v1.2.7)對數據進行嵌合過濾，并根據barcode序列將序列拆分，各自回歸到對應樣品；用QIIME軟件(v1.8.0)進行OTUs聚類，根據OUTs聚類結果，對每個OTU 的代表序列做物種注釋，得到相應的物種信息和基于物種豐度的分布情況；同時計算 OTUs豐度、Alpha多樣性指數，使用Unweighted UniFrac進行Beta多樣性分析；根據Beta多樣性分析結果，使用R軟件繪制出主坐標成分分析圖(PCoA)，并采用在線分析程序LEfSe(http:∥huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/)挖掘差異微生物。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠胃黏膜組織病理學結果比較

圖1示，空白組胃黏膜組織結構清晰，層次分明，未見萎縮、脫落或損傷。模型組可見黏膜上皮細胞出現變性、壞死脫落，間質水腫，細胞間隙增寬明顯，深部細胞排列疏松，中性粒細胞浸潤。胃經穴組胃黏膜結構基本正常，淺層有細胞脫落，有少許炎性細胞浸潤；對照點組較模型組胃黏膜組織結構損傷程度輕，可見損傷、深部細胞間隙增寬、存在充血及炎性細胞浸潤。

圖1 大鼠胃黏膜病理學結果比較(HE染色，×400)

2.2 各組大鼠胃黏膜組織NT蛋白表達比較

圖2示，模型組胃黏膜NT表達量較空白組顯著降低(P<0.01)，胃經穴組和對照點組NT表達均顯著高于模型組(P<0.01，P<0.05)，對照點組NT蛋白表達明顯低于胃經穴組(P<0.05)。

注：與空白組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05；與胃經穴組比較：4)P<0.05圖2 各組大鼠胃黏膜NT蛋白的表達量比較只/組)

2.3 各組大鼠腸道微生態分析比較

2.3.1 各組大鼠腸道微生態Beta多樣性分析 圖3示，空白組、模型組、胃經穴組和對照點組大鼠腸道菌群差異通過PCoA分析進行歸類。所有組別大鼠在PCoA圖上均能各自聚類未發生重疊，說明各組大鼠的腸道菌群Beta多樣性具有差異。與空白組比較，模型組的腸道菌群菌落分部離空白組距離更遠，說明差異更大；相比對照點組、胃經穴組的腸道菌群菌落分部距離空白組更近，說明胃經穴組與空白組差異相對較小。

圖3 基于OTU豐度矩陣的PCoA判別分析

2.3.2 各組大鼠腸道微生態差異性分析 圖4、5示，應用LEfSe分析程序，將logarithmic LDA score設為2，大于設定值的為具有統計學差異物種，差異物種跟隨組別進行著色，獲得空白組、模型組、胃經穴組和對照點組腸道菌群的lda值分部圖。從豐度水平看，與空白組比較，模型組中含有較多紅蝽菌科(coriobacteriaceae)、紅蝽菌目(coriobacteriales)、紅蝽菌綱(coriobacteriia)、柯林斯氏菌屬(collinsella)、產氣柯林斯菌(collinsella aerofaciens)、梭菌屬(clostridium)，含有較少的孿生菌科(gemellaceae)、孿生菌目(gemellales)和活潑瘤胃球菌種(ruminococcus gnavus),差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組和對照點組比較，胃經穴組中含有較多的放線菌門(actinobacteria)、放線菌目(actinomycetales)、tm7門、瘤胃菌科(ruminococcaceae)、雙歧桿菌科(bifidobacteriaceae)、雙歧桿菌屬(bifidobacterium)、雙歧桿菌目(bifidobacteriales)、瘤胃菌科(ruminococcaceae)、瘤胃菌屬(ruminococcus)、寡源桿菌屬(oligella)、偽長雙歧桿菌(bifidobacterium pseudolongum)和F16科，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組和胃經穴組比較，對照點組中含有較多的布勞特氏菌屬(blautia)、producta目、產堿桿菌目(un_f_Alcaligenaceae)，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖4 空白組、模型組大鼠差異腸道菌群的LEfSE分析

圖5 模型組、胃經穴組、對照點組大鼠差異腸道菌群的LEfSE分析

3 討論

“熱證可灸”是指用艾灸法治療熱性疾病，是針灸學的經典理論。早在《素問·六元正紀大論篇》便有“火郁發之”的記載，指用因勢利導的方法治療火熱之證。后世的《理瀹駢文》[9]言:“若夫熱證亦可以用熱者,一則得熱行也,一則以熱引熱,使熱外出也，即從治之法也。”明·李梴撰寫的《醫學入門》[10]也提到:“實者灸之，使實邪隨火氣而發散也……熱者灸之，引郁熱之氣外發, 火就燥之義也”，說明艾灸用于治療熱證具有深厚的理論基礎，并在歷代有不少醫家付諸于實踐。《千金翼方》[11]則指出：“治胃中熱病，膝下三寸名三里，灸三十壯。”《靈樞·五邪》云：“邪在脾胃……則有寒有熱，皆調于三里”，說明胃腑熱證的治療可選足三里穴。梁門穴位居胃腑門戶，屬近治穴位亦為足陽明經穴，然“經脈所過，主治所及”。《針灸甲乙經》[12]記載到：“腹中積氣結痛梁門主之”，故梁門具有和胃止痛、健胃調中之功效，常與足三里配伍治療胃脘部疾病。胃熱證與現代醫學所指的胃炎相對應，表現為胃黏膜的炎性損傷。有研究認為，各種方法治療胃炎都是通過促進胃黏膜保護和再生活性起作用[13]，而艾灸足三里、梁門穴對胃黏膜的保護作用具有一定的穴位特異性[14]。艾灸能通過抑制炎性因子促進胃黏膜修復[15]，通過調節胃黏膜保護相關因子，抑制胃黏膜的細胞凋亡，從而促進胃黏膜的修復[16]。

NT是存在于腦和胃腸道中的十三肽，參與中樞神經系統和外周胃腸道的許多生理過程[17]。 研究表明，NT對胃腸道功能具有協調作用，參與胃腸道消化、運動、炎癥反應等功能的調節[18]。課題組前期研究顯示，電針胃經穴能通過調節NT蛋白表達促進胃黏膜損傷修復[19]。本實驗結果中，艾灸胃經穴干預7 d后，下降的NT表達水平得到顯著提高，說明艾灸胃經穴能通過調節NT蛋白的表達水平,改善胃熱證大鼠胃黏膜的炎性損傷。

胃腸道微生物組成具有多樣性，其穩態對胃腸道屏障的組成和疾病的預防發展具有重要意義[20]。本實驗中，各組大鼠腸道菌群菌落分布具有顯著差異，而胃經穴組與空白組差距較小，說明艾灸胃經穴對胃熱證大鼠的腸道菌群菌落分布有調節作用。從腸道微生物物種差異分析，模型組中含有較多的致病菌，如紅蝽菌科、柯林斯氏菌屬及梭菌屬。紅蝽菌科家族成員被認為是致病菌，而柯林斯氏菌是其主要分類群[21]。Chen J等[22]研究認為，柯林斯菌的增多能使腸道通透性增加，并且可能導致中性粒細胞聚集和NFkB通路的激活而誘發炎性疾病。而梭菌屬其形成的異質群體包含許多密切相關的物種，具有致病性且常導致嚴重疾病[23]。因此，這幾類致病菌增多使菌群結構失調而誘發的胃腸道炎性病變，可能是誘導大鼠產生胃熱證的重要原因之一。相比各組大鼠，胃經穴組中則含有較多的益生菌，如放線菌門、雙歧桿菌科、雙歧桿菌屬和瘤胃球菌屬。其中放線菌門下的雙歧桿菌被認為是腸道中較有益的菌群，具有調節腸道疾病、增強宿主免疫功能和改善消化的作用[24-25]。雙歧桿菌科具有多種益生功能，能改善因腸道菌群失調引起的疾病，如便秘、腹瀉，減輕因腫瘤壞死因子(TNF-α)和脂多糖引起的炎癥反應[26]。雙歧桿菌屬則對胃黏膜的完整性具有保護作用[27]，這些益生菌豐度的上調，可能是艾灸通過調節腸道菌群物種治療胃熱證的機制之一。

綜上，本實驗通過研究艾灸對胃熱證大鼠腸道微生態的影響，發現艾灸胃經穴能顯著上調益生菌豐度水平，結合胃黏膜病理形態學及NT蛋白表達檢測，證明艾灸胃經穴對治療胃熱證的有效性，說明艾灸胃經穴能通過相關機制對胃熱證大鼠起正向調節作用，對揭示“熱證可灸”理論的可行性及科學性具有創新意義。