食源性酪氨酸氧化產物誘導小鼠心肌氧化損傷及能量代謝障礙的機制

呂一品，唐 雪，李博文，葛月婷，楊紹軍，張 凱，馬淑華

（江南大學食品學院，食品營養與功能食品工程技術研究中心，江蘇 無錫 214122）

酪蛋白廣泛存在于食品加工體系中，加工過程中極易氧化生成雙酪氨酸（dityrosine，DT）、3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）和3-氯酪氨酸等酪氨酸氧化產物（tyrosine oxidation product，OTP）[1]，其中DT常被作為判斷食品蛋白質氧化程度的標準[2]。在市售牛奶[3]、噴霧干燥奶粉[4]以及肉類模型系統[5]中均可檢測到OTP和DT存在。食源性OTP會造成食品品質和營養價值降低[6]，且OTP化學結構穩定，對酸解和蛋白酶水解過程具有抵抗性，可完整地被腸道吸收進入血液循環，在組織細胞中蓄積。研究發現，大鼠長期飼喂含OTP和DT日糧均可造成血液、肝、腎DT累積，自由基含量升高，引起脂代謝紊亂和脂質積累，導致肝腎功能損傷及纖維化病變[7]。Ding Yinyi等結合動物和細胞實驗證實OTP、DT導致胰島素分泌顯著降低，引起糖代謝異常和胰腺細胞凋亡，具有較強的促氧化能力，對人體健康具有潛在危害[8]。然而攝入的食源性OTP如何影響機體能量代謝，導致組織器官氧化損傷和功能紊亂，其相關作用機制尚不明確，還需進一步研究。

心臟作為機體最重要的器官之一，為血液流動提供動力，對能量和氧的需求量極高。線粒體作為ATP產生和自由基生成的主要細胞器，其結構改變、數量減少及ATP生成不足是導致心室功能障礙、心臟衰竭等疾病發生的基礎[9]。研究發現，蛋白質氧化后不僅影響了心臟對氨基酸的利用，且血液氧化蛋白產物累積與心血管疾病的發生密切相關，可作為判斷缺血性心臟病的特異性指標[10]。本課題組前期研究發現OTP可引起大鼠心肌纖維斷裂溶解，線粒體腫大、形成空泡、嵴數量減少，出現心肌纖維和線粒體損傷[11]。然而，食品OTP攝入引起心肌損傷及線粒體功能異常的相關機制尚未明確，DT作為OTP的重要組分其氧化損傷機制還有待進一步研究。因此，本研究以生長期小鼠為實驗對象，探究食源性OTP和DT對小鼠心肌氧化還原穩態、線粒體功能及能量代謝的影響，進一步明確食源氧化蛋白作用機制，為完善食物蛋白質營養理論、減少現代食品加工對健康的危害提供有價值的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

3 周 齡S P F 級 雄 性C 5 7 B L/6 小 鼠3 0 只 ， 使 用許可證號：S Y X K（蘇）2 0 1 6-0 0 4 5，動物合格證編號：20170005006323，實驗倫理審核編號：JN.No20190330c0900820，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養于江南大學實驗動物中心，飼養溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，晝夜循環光照12 h/12 h，自由進食飲水，每周稱量并記錄體質量。

酪氨酸購自美國Sigma公司；酪氨酸氧化產物根據文獻[12]報道的方法制得；雙酪氨酸（dityrosine，DT）香港銳東生物科技公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、錳-超氧化物歧化酶（MnSOD）、總蛋白試劑盒 上海碧云天生物技術公司；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、游離脂肪酸（free fatty acid，FFA）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）和ATP酶（ATPase）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；乙酰輔酶A、NADH、NAD+、C反應蛋白（C reactive protein，CRP）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、DT酶聯免疫吸附反應試劑盒 廈門慧嘉生物科技有限公司；RNA提取試劑盒和引物 上海生工生物工程有限公司；OligdT、dNTP、RNase抑制劑、M-MLV逆轉錄酶美國Thermo Fisher公司；Quantitect SYBR Green PCR Kits南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Nano Drop分光光度計、M5酶標儀 美國Molecular Devices公司；CFX96 Touch實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；5804R臺式高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司；微量移液器 德國Eppendorf公司；MPI-B型化學發光檢測儀 西安瑞邁分析儀器有限責任公司；電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；ETC811 PCR擴增儀 東勝興業科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及預處理

C57BL/6小鼠普通飼料適應性預飼養1 周后，隨機組別為3 組，每組10 只：對照組（Con）、酪氨酸氧化產物組（OTP）和雙酪氨酸組（DT），各組每天分別灌胃420 μg/kgmb的酪氨酸溶液、1 909 μg/kgmb的OTP和420 μg/kgmb的DT溶液，連續35 d。本研究采用生長期小鼠，在其3 周可離乳獨立生長時開始適應性培養，之后灌胃35 d至其體成熟。較之前研究[8]縮短了灌胃周期，故提升DT灌胃劑量至420 μg/kgmb，實驗所用的OTP中DT質量分數約為22%，為保持兩組DT質量分數一致，將OTP灌胃劑量設為1 909 μg/kgmb。實驗結束后小鼠禁食12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后摘眼球取血至抗凝管內，3 500 r/min、4 ℃離心10 min，取上層血漿，-80 ℃保存。小鼠斷頸處死后，在冰浴上迅速摘取心臟，用預冷的生理鹽水漂洗后稱質量，按下式計算心臟指數。

取0.05 g左右心肌組織加入生理鹽水勻漿制得體積分數10%組織勻漿，3 500 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液，-80 ℃保存。取0.05 g左右心肌組織置于TRIzol試劑中，-80 ℃保存用于總RNA的提取。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 ROS水平測定

新鮮取到的小鼠全血，采用luminol化學發光法測定[13]，用Origin 8.0軟件對實驗峰面積進行積分，以單位體積下相對發光強度表示活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。

1.3.2.2 氧化還原及心肌損傷指標測定

T-AOC、CAT、GSH-Px、MDA、SOD、ATPase、DT、CRP、TNF-α水平的測定均按試劑盒說明書操作。

1.3.2.3 總RNA的提取與反轉錄

利用T R I z o l 法提取心肌組織中的總R N A，用Nano Drop分光光度計測定RNA的純度和濃度，對于A260nm/A280nm在1.8～2.0的合格樣品進行反轉錄，所得cDNA儲存于-20 ℃備用。

1.3.2.4 實時熒光定量PCR

根據試劑盒說明書，測定抗氧化，線粒體合成及凋亡相關基因的表達量，引物序列如表1所示。通過實時熒光定量PCR進行擴增，測得各模板的Ct值，用2－ΔΔCt法計算，以β-actin為內標，進行相對定量[14]。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Sequences of primers used for real-time quantitative PCR

1.4 數據統計分析

結果均以平均值±標準差表示，采用SPSS 18.0軟件對數據進行處理，運用方差分析、Tukey檢驗進行組間顯著性差異分析，P＜0.05表示組間有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 酪氨酸氧化產物對小鼠體質量、心臟指數及心肌損傷相關指標的影響

圖1 酪氨酸氧化產物對小鼠體質量（A）和心臟指數（B）的影響（n＝ 10）Fig. 1 Effects of tyrosine oxidation products on body mass (A) and cardiac index (B) in mice (n = 10)

如圖1A所示，整個實驗期間，3 組體質量在各時間點均無顯著性差異（P＞0.05），但灌胃DT和OTP 35 d可顯著提高小鼠心臟指數（P＜0.05）。CRP是冠心病和全身炎癥的生物標志物之一[15-16]，其水平在組織損傷、感染和其他炎癥刺激下升高[17]。TNF-α是一種具有多種生物學效應的細胞因子和免疫調節因子，在抑制心肌收縮性、促進心肌重構、引起內皮心肌細胞凋亡中起重要作用[18]。CK和LDH是心肌能量代謝過程中的重要酶，病理狀態下血漿CK和LDH活性的升高[19]。

表2 酪氨酸氧化產物對小鼠血漿心肌損傷指標的影響（n＝ 10）Table 2 Effects of tyrosine oxidation products on myocardial injury index in plasma of mice (n= 10)

表3 酪氨酸氧化產物對小鼠心肌ROS及氧化產物的影響（n＝ 10）Table 3 Effects of tyrosine oxidation products on ROS and oxidation products in myocardia of mice (n= 10)

由表2、3可知，小鼠灌胃DT和OTP可顯著提高小鼠心肌蛋白質氧化產物DT、AOPP和3-NT以及脂質氧化產物MDA的蓄積，引起血漿TNF-α水平和CK、LDH活力顯著提高（P＜0.05），表明OTP和DT灌胃引發小鼠心肌組織損傷和炎癥反應。

2.2 酪氨酸氧化產物對小鼠心肌氧化還原穩態的影響

ROS是人體能量代謝的副產物，在健康機體內處于動態平衡狀態[20]。當機體受到有害因素刺激時，細胞抗氧化能力下降導致ROS的動態平衡被破壞，從而引起機體氧化應激[21]。

表4 酪氨酸氧化產物對小鼠血漿氧化還原指標的影響Table 4 Effects of tyrosine oxidation products on plasma redox index in mice

如表4和圖2所示，與Con組相比，DT和OTP灌胃顯著提高了小鼠血漿ROS水平，降低了血漿CAT活力以及心肌組織T-AOC和CAT、SOD活力（P＜0.05），OTP組血漿T-AOC、SOD活力亦顯著降低，表明DT和OTP可降低血漿、組織抗氧化能力，引起氧化損傷。Nrf2通路是細胞內重要的抗氧化調節通路，Pi3k和Gsk3β是Nrf2的上游調控因子，其中Gsk3β抑制Nrf2，而Nqo1是Nrf2下游調控表達的抗氧化酶[14]。實時熒光定量PCR結果顯示，DT和OTP灌胃顯著下調小鼠心肌抗氧化相關基因（Pi3k、Ampk、Nrf2、Nqo1）mRNA表達水平，而顯著上調Gsk-3β表達水平（P＜0.05），表明DT和OTP引起心肌組織氧化還原穩態失衡與抑制抗氧化通路關鍵因子表達有關。

圖2 酪氨酸氧化產物對小鼠心肌氧化還原狀態的影響Fig. 2 Effects of tyrosine oxidation products on myocardial redox state in mice

2.3 酪氨酸氧化產物對小鼠心肌組織線粒體功能和能量代謝的影響

表5 酪氨酸氧化產物對小鼠心肌能量代謝的影響Table 5 Effects of tyrosine oxidation products on myocardial energy metabolism in mice

FFA是心肌細胞最主要的供能物質，FFA在心肌積聚能增加細胞耗氧量，影響能量代謝，降低心肌收縮力，促進心肌梗死時酶的釋放，嚴重時可引起心律失常[22]。如表5所示，與Con組相比，DT組和OTP組小鼠心肌FFA含量顯著提高，而NADH/NAD+比值、乙酰輔酶A含量以及ATPase、LDH活力顯著降低。乙酰輔酶A含量、NADH/NAD+比值與線粒體ATP生成密切相關。ATPase作為一種離子泵，是維持細胞內外離子平衡的重要物質，其活性的降低會引發細胞內陽離子超載，產生毒害作用，加重心肌損傷[23]。上述結果表明，DT和OTP抑制了線粒體氧化磷酸化進程，破壞了胞內氧化還原穩態，引起脂質在胞內的累積。

圖3 酪氨酸氧化產物對小鼠心肌線粒體生物合成相關基因的影響Fig. 3 Effects of tyrosine oxidation products on mRNA expression levels of myocardial mitochondrial biosynthesis-related genes in mice

此外，如圖3所示，DT和OTP灌胃顯著下調了小鼠心肌線粒體合成相關基因Pgc1α、Tfam和Pparα的mRNA表達水平（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），表明DT和OTP引起心肌組織損傷及氧化還原穩態失衡與影響線粒體生物合成有關。

3 討 論

食源性OTP化學結構穩定，已被證實可抵抗酸解和蛋白酶水解，攝入后可經腸道完整吸收進入血液循環，在肝、腎[24]、胰腺[8]、腦組織[7]中蓄積。研究發現，小鼠長期攝食OTP日糧極易促發胰腺氧化應激反應[8]，誘導肝腎纖維化[25]和大腦學習記憶功能減退[7,26]。代謝組學分析結果顯示灌胃320 μg/kgmbDT溶液6 周顯著降低了小鼠血漿3-羥基丁酸和白蛋白水平，增加血漿、尿液中氧化三甲胺含量，抑制脂肪酸代謝和蛋白質合成，大幅增加了患心血管疾病的風險[27-28]，提示食源性OTP對心臟及其功能具有潛在危害。

本研究發現小鼠分別灌胃1 909 μg/kgmbOTP和420 μg/kgmbDT溶液35 d，可引起心臟指數增加，心肌組織DT、AOPP和3-NT大量蓄積，血漿CRP、TNF-α水平和CK、LDH活力顯著提高。上述結果表明OTP和DT灌胃可引發小鼠心肌組織損傷及炎癥反應，這與張會等報道DT灌胃造成小鼠血漿炎性因子顯著提高的實驗結果[29]一致。心肌梗死患者心臟存在大量DT蓄積，可作為心肌梗死早期診斷的指標[30]。患有心肌病的糖尿病小鼠主動脈中3-NT含量顯著高于正常小鼠[31]。研究證實，酪氨酸氧化產物在組織中大量蓄積會影響正常氨基酸和蛋白質的化學結構及生理功能，導致酶活性的降低及細胞凋亡[32]。

為了進一步探究OTP和DT損傷心肌組織的可能機制，本實驗測定了氧化還原相關指標及基因表達水平。結果顯示，與Con組相比，OTP和DT灌胃顯著提高了小鼠心肌ROS水平，降低了T-AOC水平及抗氧化酶（CAT、SOD和GSH-Px）活力，導致脂質過氧化產物MDA過量累積，引起心肌氧化應激和抗氧化能力降低，這與趙琪等研究結果[33]一致。體內過量的ROS參與蛋白質、核酸等生物大分子氧化，可引起氧化產物蓄積，刺激產生更多ROS，進一步加重氧化應激。氧化應激不僅引起心肌炎癥反應和組織損傷，而且進一步導致心肌纖維化[34-36]，與心肌缺血再灌注損傷、急性心肌缺血和糖尿病心肌病的發生發展密切相關[37]。此外，實時熒光定量PCR結果顯示抗氧化相關基因Pi3k、Ampk、Nrf2、Nqo1mRNA表達水平顯著下調，而抑制因子Gsk-3β表達顯著上調。Nrf2/ARE通路受損是糖尿病的主要特征之一[38]，心力衰竭導致大鼠心肌組織中Pi3k/Akt/Gsk-3β通路上各關鍵因子顯著下調[39]，表明OTP和DT引起心肌組織氧化能力降低及氧化損傷與抑制抗氧化信號通路關鍵因子表達有關。

線粒體是能量代謝的主要部位，也是ROS產生和攻擊的主要靶點。氧化應激引起線粒體功能異常主要表現在線粒體DNA及內含物減少，ATP合成減少[40-41]。氧化應激引起的線粒體能量代謝障礙被認為是心功能障礙的主要因素之一[42-43]。本研究結果發現，DT和OTP灌胃導致小鼠心肌組織乙酰輔酶A水平、NADH/NAD+比值顯著降低，抑制了ATPase和LDH活性，提示心肌糖酵解途徑和線粒體氧化磷酸化過程受阻。同時，心肌脂肪酸利用率下降，導致FFA進一步積累。此外，DT和OTP顯著下調了心肌Pgc1α、Pparα、Tfam表達水平，對線粒體的生物合成及功能產生不利影響。可見，DT和OTP導致心肌氧化損傷機制與抑制線粒體能量代謝與生物合成密切相關。

DT是OTP的重要產物，常被作為判斷食品蛋白質氧化程度的標準[44]。Ding Yinyi等發現DT具有與T3類似的結構，可競爭性結合胰腺T3受體，抑制T3生理效應的發揮，導致胰腺細胞ATP生成不足，胰島素分泌降低[45]。通過比較分析OTP組與DT組各項指標，發現DT對心肌氧化應激及能量代謝等各指標的影響與OTP一致，且無顯著性差異，提示DT可能是OTP誘導心肌氧化損傷的關鍵成分，進一步深入研究可為闡明OTP作用機制提供可靠的理論依據。

3 結 論

本實驗探究了食源性OTP和DT對小鼠心肌氧化還原穩態，線粒體功能及能量代謝的影響。結果表明OTP和DT均可導致蛋白質及脂質氧化產物的積累，降低抗氧化酶活性，引起心肌組織氧化應激與炎性反應。同時，通過影響線粒體生物合成及抗氧化通路相關基因表達，抑制線粒體的生物合成與能量代謝。DT作為OTP的重要成分，在OTP誘導的心肌損傷過程中起關鍵性作用。