藻藍色素蛋白抑制A549細胞活性機制的miRNA 轉錄組學分析

郝 帥，李 爽，王 靜，劉媛璞，趙 磊，張佳雯，王成濤

（北京市食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京工商大學食品與健康學院，北京 100048）

食用藻藍色素蛋白是一種安全的天然功能性食品，除了作為添加劑用于多種食品著色以外[1]，近年來，越來越多的證據表明，藻藍蛋白還具有抗氧化、抗衰老、調節免疫、抗腫瘤、抗炎等多種生物學功能[2-6]。深入研究藻藍蛋白的生物活性及其調控機制，能夠為其深度開發和利用提供重要的理論參考。

肺癌是目前我國第一大腫瘤疾病。工業廢氣、汽車尾氣的大量排放所造成的環境問題日益嚴重，是我國肺癌發生率逐年提高的重要誘導因素[7]。同時，隨著我國人口老齡化程度的加劇，自1998年到2015年，我國的肺癌發病率和死亡率始終保持不斷上升的趨勢，肺癌已經成為危害我國居民健康的最主要的惡性腫瘤[8-9]。肺癌的病理分型可以分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中小細胞肺癌主要以H446、H524、H20等細胞系為典型代表，發病比例較低；非小細胞肺癌則主要包括肺鱗癌（H226等）、肺腺癌（LTEP-a2、A549、H1299等）和大細胞肺癌（H460等）三大亞類[10-12]。在近年來被診斷的肺癌病例中，約85%屬于非小細胞肺癌[13-14]。已有研究表明，藻藍蛋白對多種非小細胞肺癌具有生長抑制作用，并且能夠促進肺癌細胞的凋亡和體外遷移[15-18]。但是，目前大部分的研究僅針對于藻藍蛋白與單一細胞蛋白或宏觀的信號通路之間的關系，與細胞內小分子的調控作用尚不明確。因此，深入探究藻藍蛋白對非小細胞肺癌的調控機理，可為其預防、診斷甚至治療提供新的思路和依據。

非編碼小RNA（microRNA，miRNA）是非編碼RNA的一類，大約由20 個左右的堿基組成高保守調控型的內源性RNA[19-20]，在動植物細胞中參與基因的轉錄后表達調控作用，能夠通過靶向結合到生物體mRNA的3’非翻譯區上引起mRNA的降解或者翻譯抑制作用[21]。研究表明miRNA能夠作為原癌因子或抑癌因子在多種腫瘤細胞中參與調控作用，例如，miR-137能夠通過下調PAK2蛋白的表達而抑制惡性黑色素瘤細胞的增殖[22]，miR-494能夠靶向抑制CDC20的表達而誘導神經膠質瘤細胞的凋亡[23]；此外，miR-125b則能夠分別在惡性血液病腫瘤和實體瘤中發揮原癌因子和抑癌因子的作用[24-25]。因此，miRNA對于腫瘤的發生、發展和調控具有至關重要的作用。目前，雖然在肺癌中也發現存在許多諸如miRNA-148a[26]、miR-21[27]、miR-17-92[28]等miRNA的調節，但藻藍蛋白抑制非小細胞肺癌過程中所參與的miRNA尚不明確，相關文獻也鮮有報道。本研究以典型的非小細胞肺癌A549細胞系為模型，在藻藍蛋白處理后，采用高通量非編碼小RNA轉錄組技術（miRNA-seq）分析潛在的差異miRNA，進一步深入揭示藻藍蛋白對非小細胞肺癌的調控機制，為功能性藻藍蛋白的開發和利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人類非小細胞肺癌A549細胞，購于ATCC，由北京市食品添加劑工程技術研究中心實驗室保存。

藻藍蛋白標準品 美國Envirologix公司；DMEM細胞培養基 美國Gibco公司；胎牛血清 天津康源生物技術有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒 北京天根生物技術有限公司；TRIzol試劑北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

細胞培養箱 德國Heraeus公司；漩渦振蕩儀德國IKA公司；超凈工作臺 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；數字型電子天平 德國Sartorius公司；CFX96Touch qPCR儀 美國Bio-Rad公司；Bioanalyzer2100核酸檢測儀 美國安捷倫公司；miRNA-seq高通量測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

A549細胞培養于含有體積分數10%胎牛血清、0.1 mg/mL鏈霉素以及100 units/mL青霉素的DMEM培養基中，在37 ℃、5% CO2條件下培養。細胞每3～4 d傳代一次，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.2 藻藍蛋白處理A549細胞

提前一天將細胞進行傳代處理，細胞密度大約50%。第2天細胞完全貼壁后采用藻藍蛋白處理A549細胞，做3 個平行藻藍蛋白處理組與對照組（磷酸鹽緩沖液處理細胞）。處理后48 h后收集細胞進行后續實驗。研究結果中1～3號樣品為對照組；4～6號樣品為藻藍蛋白處理組。

1.3.3 RNA文庫構建

采用TRIzol法提取細胞總RNA，使用NanoDrop 2000測定RNA濃度，隨后對RNA的完整性進行分析。采用小RNA建庫試劑盒進行miRNA文庫構建。

1.3.4 miRNA測序與序列分析

采用Illumina Hiseq 2000進行miRNA的測序。對所獲得的原始序列進行過濾，去除低質量的序列；隨后去除5’端和3’端接頭序列、污染序列，以及小于18 nt和大于30 nt的序列，得到純凈序列。統計長度在16～27 bp的RNA序列長度的分布情況，然后選取GenBank數據庫和Rfam數據庫分別注釋序列，盡可能發現并去除樣本中的rRNA、snRNA、scRNA等。最后通過基因組比對除去重復序列和mRNA的降解片段。

1.3.5 miRNA的鑒定與差異分析

通過比對miRbase中已經收錄的miRNA，鑒定到的為已知miRNA；結合參考序列進行發卡結構的預測，鑒定到的為新的miRNA。結合miRNA在各樣本中的表達情況，得到全部miRNA的表達譜。將表達量變化2 倍以上且P＜0.05的miRNA定義為差異表達的miRNA。

1.3.6 miRNA的靶基因預測和功能富集

使用Pathmatch軟件進行靶基因的預測，然后對靶基因進行人類基因組和NCBI數據庫注釋，以及基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。

1.3.7 qPCR驗證miRNA的表達

對每一個檢測樣品需要將待檢測的miRNA與其內參U6分別進行反轉錄反應。根據RNA濃度計算2 μg所需要的體積，與DEPC混合至9 μL，每管中再分別加入2 μL的RT引物工作液（500 nmol/L），其中逆轉錄miRNA組中加入miRNA逆轉錄引物，逆轉錄U6組中加入U6逆轉錄引物。70 ℃、10 min后立即置于冰上。隨后將第一步反應產物進行逆轉錄反應：42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min，預冷至4 ℃。逆轉錄結束后即可進行miRNA的擴增反應，檢測miRNA時加入miRNA正向通用引物與Bulge-Loop miR反向通用引物，檢測U6時加入U6正向引物與反向引物。

1.4 數據統計分析

實驗數據均以平均值±標準差表示，采用SPSS 11.0軟件進行單因素方差分析，其中P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著差異。

2 結果與分析

2.1 藻藍蛋白對A549細胞體外增殖活性的影響

首先利用不同濃度的藻藍蛋白（0、0.6、1.2、2.4、4.8 μmol/L）處理體外培養的A549細胞，檢測細胞的存活率。由圖1A可知，隨著藻藍蛋白濃度的增大，細胞的存活率顯著降低，呈現明顯的劑量依賴效應。因此，在后續的實驗中，采用效果極顯著的藻藍蛋白濃度（4.8 μmol/L）進行細胞處理實驗。由圖1B可以發現，采用4.8 μmol/L的藻藍蛋白處理細胞，能夠顯著抑制A549細胞的體外增殖能力。以上結果表明藻藍蛋白對A549細胞的生長具有明顯抑制效果，隨后對其具體的調控機制進行了深入的測序分析。

圖1 藻藍蛋白對A549細胞體外增殖活性的影響Fig. 1 Effect of phycocyanin on in vitro proliferation of A549 cells

2.2 RNA樣品的質量檢測

首先對藻藍蛋白處理后的細胞進行了總RNA的提取，并進行轉錄組測序前的質量檢測。圖2分別顯示了對照組（圖2A）和藻藍蛋白處理組（圖2B）的RNA完整性分析結果。結果顯示，RNA的18S和28S亞基均出現了完整的峰，且集中程度較高，初步提示了RNA結構的完整性。此外，表1顯示了RNA質量檢測的基本參數，結果表明，6 個樣品的RNA總量均超過了20 μg，OD260nm/280nm均大于1.8，RNA完整性參數（RNA integrity number，RIN）值均大于9，表明提取的RNA樣本結構完整，沒有發生明顯降解，滿足miRNA轉錄組測序的后續實驗。

圖2 RNA完整性檢測結果Fig. 2 Analysis of the integrity of RNA

表1 不同樣本RNA的質量檢測數據Table 1 Quality evaluation of different RNA samples

2.3 sRNA的測序分析結果

表2 不同樣本中sRNA的統計結果Table 2 Statistical data of sRNA in different samples

miRNA-seq的測序結果不僅能提供miRNA的讀長，還能提供其他類型RNA的相關信息。表2顯示了包括miRNA在內的不同類型RNA的測序讀長。結果顯示，除了已知miRNA（known miRNA）和未知的新預測miRNA（novel miRNA）以外，核糖體RNA（rRNA）、轉運RNA（tRNA）、核仁小分子（snoRNA）、小核RNA（snRNA）、重復序列（repbase）、外顯子（exon）、內含子（intron）以及未知的sRNA序列（unknown）都被測序出來。在對照組中，已知m i R N A 占所有sRNA測序讀長的（42.53±6.56）%，新預測的miRNA則占（6.51±0.66）%；在藻藍蛋白處理組中，已知miRNA和新預測miRNA則分別占所有sRNA測序讀長的（12.59±0.82）%和（3.06±0.09）%。雖然在測序讀長信息上，對照組和藻藍蛋白處理組存在較大的差異，但二者在miRNA成熟體上均測序出了相近的數量（表3）。結果顯示，對照組和藻藍蛋白處理后，miRNA成熟體（包含已知miRNA和新預測的miRNA）數量均達到了1 000 條以上。以上研究結果表明，miRNA-seq成功地篩選出了一批潛在的miRNA，構建了miRNA分析文庫，是進一步尋找藻藍蛋白調控差異miRNA的基礎。

表3 不同樣本中miRNA成熟體數量統計Table 3 Statistics of mature miRNAs in different samples

2.4 miRNA在不同樣本中的表達量分析結果

不同類型的miRNA在細胞中發揮著不同的生理功能，所占的比例也大不相同[29]。本研究分析了對照組和藻藍蛋白處理組中的miRNA豐度，篩選出了各樣本中表達量前10 位的miRNAs。圖3結果顯示，高豐度的新預測miRNA在不同樣本中的表達模式基本一致，其中豐度前5 位分別為：18_34113、20_36370、14_27440、22_37559以及16_30535，表明這些新預測的miRNA在藻藍蛋白處理前后較穩定，可能不是藻藍蛋白主要的調控因子；相反，一些其他新預測的miRNA（例如17_31507）在藻藍蛋白處理組均有一定量的表達，但并沒有出現在對照組中，提示這一類新預測的miRNA可能受到了藻藍蛋白的影響，出現表達量的差異性變化。新的miRNA僅僅是測序信息的預測結果，具體是否可靠還需要進一步的驗證。此外，對于已知的miRNA，圖3結果顯示，6 個研究樣本中，高豐度的已知miRNA（例如miR-21-5p、miR-27b-3p等）均出現較一致的表達模式。并且有研究表明，miR-21-5p能夠通過靶向調控TGFBI和SMAD7抑制肺癌細胞的生長[30-31]，miR-27b-3p也被報道在肺癌的發生過程中起到調控作用[32]。以上結果表明，藻藍蛋白在A549細胞中的調控很可能是作用于一些低豐度的特異性miRNA，因此，對不同處理的樣本進行了差異miRNA的篩選分析，進一步篩查藻藍蛋白可能調控的miRNA。

圖3 各樣本中表達量前10 位的miRNAsFig. 3 Top 10 most expressed miRNAs in each sample

2.5 差異miRNA的篩選分析結果

圖4 藻藍蛋白處理A549細胞后差異miRNA的火山分布圖Fig. 4 Volcano map of differentially expressed miRNAs in A549 cells after undergoing phycocyanin treatment

采用miRNA-seq高通量測序，對藻藍蛋白處理后的差異miRNA進行了篩選分析。圖4結果表明，藻藍蛋白處理后，均有miRNA出現了上調或下調的表達。通過統計分析，共有136 個差異miRNA被篩選出來，其中藻藍蛋白處理后顯著上調的miRNA有74 個，顯著下調的miRNA有62 個。表4顯示了樣本間差異程度最高的19 個已知miRNA。由分析結果可以看出，miR-4521、miR-27b-5p、miR-7974、miR-574-5p等在藻藍蛋白處理A549細胞后表達量出現顯著下調；而miR-4485-3p、miR-146a-5p、miR-27a-5p、miR-93-5p等的表達量則在藻藍蛋白處理后出現了明顯上調。有研究表明，miR-4521對人類慢性淋巴細胞白血病發生和發展有調控作用[33]，但對肺癌細胞的生長還沒有明確的報道；而miR-27a-5p、miR-93-5p等則被發現對肺癌細胞有一定的抑制作用[34-35]。Zhou Rui等報道miR-574-5p能夠通過PTPRU促進肺癌細胞的轉移[36]，而本研究發現藻藍蛋白處理肺癌細胞后miR-573-5p出現了明顯的下調表達，這與已知的文獻報道一致。

表4 不同樣本間差異程度最高的19 個已知miRNATable 4 Top 19 most differentially expressed known miRNAs in different samples

隨后對這些差異miRNA進行了子聚類分析，圖5顯示，根據各樣本中差異miRNA表達模式的不同，這些miRNA可以聚類為4 類：與對照組相比，顯著下調表達的miRNA（A類）、極顯著下調表達的miRNA（B類）、顯著上調表達的miRNA（C類）以及極顯著上調表達的miRNA（D類）。本研究通過miRNA-seq篩選出了一批藻藍蛋白處理后差異性表達的miRNA，這些差異miRNA的發現為研究藻藍蛋白在非小細胞肺癌中的調控機制提供了重要的理論參考。

圖5 差異miRNA的不同表達模式分析Fig. 5 Expression pattern analysis of differentially expressed miRNAs in different samples

2.6 差異miRNA的驗證

對篩選得到的幾個代表性的差異miRNA進行了qPCR的生物學驗證。圖6結果顯示，藻藍蛋白處理A549細胞后，與對照組相比，miR-4521、miR-27b、miR-7974、miR-574的表達量均出現顯著下調；miR-4485、miR-146、miR-27a以及miR-93的表達量出現顯著上調，此結果與miRNA-seq的測序結果是一致的，進一步證實了這些差異miRNA確實受到了藻藍蛋白的影響，可能在藻藍蛋白抑制非小細胞肺癌過程中起到調控作用。

圖6 部分差異miRNA的qPCR驗證Fig. 6 qPCR analysis of some differentially expressed miRNAs

2.7 miRNA的靶基因功能分析結果

圖7 miRNA靶基因的GO功能注釋分析Fig. 7 GO annotations analysis of target genes for miRNAs

使用miRanda軟件對篩選出的miRNA進行靶基因的預測分析，共預測得到了5 186 個潛在的靶基因。首先對這些靶基因進行了GO注釋分析，結果如圖7所示。GO注釋可將基因分為三大類：生物過程、細胞組分和分子功能。在生物過程中，靶基因功能主要集中在代謝調控、應激反應和信號轉導等；在細胞組分和分子功能中，主要集中在分子相互作用以及酶催化活性等。GO功能注釋提供了靶基因的功能分類，但缺乏具體的功能信息，因此，為全面分析受到藻藍蛋白調控miRNA靶基因的功能，又對這些基因進行了GO富集分析（圖8）。結果顯示，細胞活動相關的許多生物學過程都在GO富集分析中出現顯著性差異，主要包括細胞離子轉運過程、細胞膜結構的調控過程、細胞增殖信號轉導調控過程、細胞骨架系統形態發生過程等。藻藍蛋白對A549細胞具有明顯的增殖抑制作用，而GO富集分析中細胞增殖信號轉導過程與本研究相一致，進一步表明了測序結果的準確性。

在預測的靶基因中，p21激活磷酸激酶4（p21 activated kinase 4，PAK4）在細胞生長與增殖過程中參與重要的調控作用，是miR-6721-5p的預測靶點；分裂原激活的蛋白激酶13（mitogen-activated protein kinase 13，MAPK 13）參與了細胞有絲分裂過程信號調控的級聯放大反應，是miR-5008-5p的預測靶點；Ras作為一種重要的GTP結合蛋白，對細胞的生長、分化、細胞骨架和蛋白運輸都有重要的影響，研究篩選得到的Ras結合結構域家族10蛋白（Ras association domain family member 10，RASSF10）被預測為miR-4769-3p的靶基因，也是藻藍蛋白抑制A549細胞生長可能的一條重要途徑。

圖8 miRNA靶基因的GO富集分析Fig. 8 GO enrichment analysis of target genes for miRNAs

3 結 論

本研究以高通量miRNA轉錄組技術為研究手段，對藻藍蛋白處理后的非小細胞肺癌A549細胞進行了測序分析。結果表明，已知和新預測的大量miRNA都被測序出，并且在不同的處理樣本中具有不同的表達模式；通過統計學分析篩選得到了136 個表達差異的miRNA，其中藻藍蛋白處理后顯著上調的miRNA有74 個，顯著下調的miRNA有62 個。根據這些差異miRNA在不同樣本中的表達情況，可以聚類為4 類不同的表達模式；qPCR對這些miRNA進行表達量的驗證，與轉錄組測序結果相吻合；此外，miRNA潛在靶基因的GO注釋和功能富集分析結果顯示，與細胞增殖信號轉導調控過程相關的靶基因例如Pak4、Mapk13、Rassf10等均被預測為差異miRNA的全新靶點，可能在藻藍蛋白抑制非小細胞肺癌增殖過程中起到重要的調控作用。不同于傳統的mRNA測序，本研究采用小分子miRNA測序技術探究了藻藍蛋白抑制肺癌細胞生長的調控機制，為抗腫瘤類功能食品因子的利用提供了理論依據，同時為非小細胞肺癌的靶向治療提供了重要的理論參考。