外周血Foxp3、RANTES聯合檢測對原因不明復發性流產的臨床診斷價值

陳艷青，張娟，呂霞明

(張家口市第一醫院婦產科,張家口 075000)

自然流產的發生率為15%～25%,連續發生3次及以上自然流產即為復發性流產,也稱習慣性流產[1]。導致復發性流產的原因多種多樣,例如,夫婦或胚胎染色體異常、孕婦內分泌異常及子宮解剖結構異常等[2]。但是約有50%的孕婦復發性流產的原因不明確,臨床上稱為原因不明復發性流產,主流觀點認為可能與母體免疫平衡失調和免疫耐受異常有關[3-4]。相關研究顯示,叉頭框蛋白p3(forkhead box protein p3,Foxp3)是與調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)發育相關的關鍵轉錄因子,在維持機體免疫耐受中發揮著重要作用[5-6]。T細胞正常表達和分泌刺激因子(regulation on activation normal T-cell expressed and secreted,RANTES)能夠特異性趨化T細胞等多種免疫細胞,參與調節機體免疫[7]。目前已有研究表明,Foxp3及RANTES與復發性流產的發生有關,然而Foxp3與RANTES對原因不明復發性流產的診斷價值尚未報道[8-9]。因此,本研究通過檢測原因不明復發性流產孕婦和正常妊娠孕婦血清Foxp3和RANTES表達水平,分析Foxp3和RANTES對原因不明復發性流產的診斷價值,為原因不明復發性流產的臨床診療提供一定幫助。

資料與方法

一、研究對象

選擇2021年7月至2022年9月本院收治的128例原因不明復發性流產患者為病例組。納入標準:(1)符合《復發性流產診治的專家共識》中原因不明復發性流產的診斷標準[10];(2)B超顯示胚胎停止發育;(3)連續發生3次及以上自然流產;(4)年齡20～40歲;(5)患者及其配偶染色體正常;(6)內分泌正常。排除標準:(1)生殖器官解剖畸形;(2)孕婦存在吸毒、吸煙、酗酒等不良嗜好;(3)妊娠期間發生病毒感染;(4)伴有免疫功能缺陷;(5)妊娠期間精神狀態嚴重異常;(6)重要臟器發生嚴重性疾病。

另選取同期于本院體檢的128例健康妊娠者為對照組。納入標準:(1)生育過健康足月胎兒;(2)無自然流產史、死產史。排除標準:(1)內分泌疾病、免疫系統缺陷、病毒感染;(2)重要臟器功能異常;(3)無上述不良嗜好;(4)距上次分娩<1年。

本研究經本院醫學倫理委員會批準。

二、研究方法

1.外周血Foxp3和RANTES水平檢測:抽取兩組受檢者空腹靜脈血5 ml,取適量血液樣品離心,保留上清液,采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測Foxp3和RANTES水平。Foxp3 ELISA試劑盒(貨號:F00843)購自上海西唐生物科技有限公司;RANTES ELISA試劑盒(貨號:A096884)購自上海撫生實業有限公司。arioskan LUX多功能酶標儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

2.免疫指標檢測:取適量血液樣品,抗凝處理后離心,分離外周單細胞并置于24孔細胞培養板中,加入胎牛血清、離子霉素、莫能菌素、佛波酯混勻,室溫孵育4 h。加入FITC標記的抗人CD4抗體和抗人CD25各10 μl,混勻后避光室溫孵育20 min,加入100 μl細胞固定液后再次孵育20 min。離心棄上清,加入破膜液100 μl,并加入抗人白細胞介素(IL)-17A和抗人Foxp3各10 μl。采用Attune CytPix成像型流式細胞儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)檢測輔助性T細胞(Th17)和Treg百分比,并計算Th17/Treg。

3.資料收集:收集兩組孕婦年齡、體質量指數(BMI)、孕周、孕次等基本資料。

三、統計學分析

結 果

一、病例組和對照組一般資料比較

病例組和對照組間年齡、BMI、孕周比較均無統計學差異(P>0.05),而孕次比較具有統計學差異(χ2=9.000,P<0.05)(表1)。

表1 病例組和對照組一般資料比較[(-±s),n(%)]

二、病例組和對照組外周血Foxp3和RANTES水平比較

經檢驗,與對照組比較,病例組外周血Foxp3[(98.55±13.67)ng/ml vs.(131.36±19.71)ng/ml]和RANTES[(179.28±25.72)ng/ml vs.(232.13±31.04)ng/ml]水平顯著降低(t=15.475、14.833,P<0.05)。

三、病例組和對照組免疫指標比較

與對照組比較,病例組Th17比例和Th17/Treg顯著升高(t=14.495、26.468,P<0.05),Treg比例顯著降低(t=13.776,P<0.05)(圖1、表2)。

圖1 病例組和對照組Th17和Treg流式細胞圖

表2 病例組和對照組免疫指標比較(-±s)

四、外周血Foxp3和RANTES水平與免疫指標和原因不明復發性流產的相關性

Pearson相關性分析結果顯示,原因不明復發性流產患者外周血Foxp3水平與Th17、Th17/Treg呈顯著負相關(r=-0.523、-0.476,P<0.05),與Treg呈顯著正相關(r=0.517,P<0.05);RANTES水平也與Th17、Th17/Treg呈顯著負相關(r=-0.469、-0.544,P<0.05),與Treg呈顯著正相關(r=0.602,P<0.05)。Spearman相關性分析結果顯示,外周血Foxp3和RANTES水平與原因不明復發性流產呈顯著負相關(r=-0.539、-0.554,P<0.05)。

五、外周血Foxp3和RANTES水平對原因不明復發性流產的診斷價值

以Foxp3和RANTES水平為檢驗變量,以原因不明復發性流產的發生為因變量繪制ROC曲線,結果顯示,血清Foxp3水平單獨診斷原因不明復發性流產發生的AUC為0.820[95%CI(0.767,0.865)],其敏感度、特異度分別為70.31%、85.94%,最佳截斷值為119.68 ng/ml;血清RANTES水平單獨診斷原因不明復發性流產發生的AUC為0.840[95%CI(0.789,0.883)],其敏感度、特異度分別為69.53%、85.16%,最佳截斷值為198.84 ng/ml;血清Foxp3和RANTES聯合診斷原因不明復發性流產發生的AUC為0.909[95%CI(0.867,0.942)],其敏感度、特異度分別為86.72%、82.81%,兩者聯合診斷的AUC顯著大于Foxp3單獨診斷的AUC(Z=4.165,P=0.000)和RANTES單獨診斷的AUC(Z=3.183,P=0.002)(圖2、表3)。

圖2 外周血Foxp3和RANTES水平診斷原因不明復發性流產的ROC曲線

表3 外周血Foxp3和RANTES水平對原因不明復發性流產的診斷價值

討 論

復發性流產會使子宮內膜變薄、導致宮腔粘連,也易出現盆腔感染和盆腔炎,嚴重則導致不孕,除了對患者身體造成一定損傷外,也會對患者心理上帶來傷害,出現焦慮、抑郁等消極情緒,影響工作和生活[11-12]。及時診斷對患者維持正常妊娠也具有重要意義,因此,外周血Foxp3聯合RANTES對原因不明復發性流產的診斷價值值得探討。

Foxp3主要表達于人類胸腺、淋巴結、脾臟等淋巴器官及組織中,人Foxp3基因定位于染色體Xp11.23,影響免疫失衡相關疾病的發生發展[13-14]。曹智等[15]研究表明,Foxp3在子宮內膜異位癥患者異位內膜組織中的陽性率高于正常組織,有望成為該疾病治療靶點。本研究結果顯示,與正常妊娠孕婦外周血Foxp3水平比較,原因不明復發性流產孕婦外周血Foxp3水平顯著降低,與趙廣彩等[8]的研究結果一致。本研究進行的Spearman相關性分析也顯示,外周血Foxp3水平與原因不明復發性流產的發生存在一定相關性,提示Foxp3與原因不明復發性流產的發生有關。進一步分析外周血Foxp3水平對原因不明復發性流產的診斷價值發現,外周血Foxp3水平診斷原因不明復發性流產發生的AUC達0.820,特異度和敏感較高,表明其診斷價值較高。

RANTES是趨化性細胞因子CC亞族成員,又稱CCL5,人RANTES基因位于染色體17q11.2-q12區域,是維持正常妊娠的重要基因[16]。張騰飛等[17]的研究發現,子宮內膜異位癥患者經治療后,血清RANTES水平降低,癥狀得到改善。本研究中原因不明復發性流產孕婦外周血RANTES水平顯著低于正常妊娠孕婦,且外周血RANTES水平與原因不明復發性流產的發生存在顯著相關性,提示原因不明復發性流產的發生可能與RANTES異常表達有所關聯。陳慧等[9]的研究中,不僅發現原因不明復發性流產的發生與RANTES有關,還發現RANTES與患者流產次數有關。本研究ROC分析表明,外周血RANTES對原因不明復發性流產具有一定診斷價值,且Foxp3和RANTES聯合診斷的AUC和敏感度高于二者單獨診斷,提示二者聯合對原因不明復發性流產的診斷價值更高,有望成為早期診斷及判斷療效的指標。

Th17和Treg是不同的T細胞亞群,Th17能夠分泌IL-17等促炎因子,從而介導機體炎癥反應,而Treg是維持機體免疫耐受的關鍵因子,能夠調節機體免疫力;Th17數量增加、Treg數量減少不利于母體免疫耐受的維持,導致流產的發生[18]。本研究發現,相比于正常妊娠對照組,病例組Th17比例和Th17/Treg顯著升高,而Treg顯著降低,提示原因不明復發性流產孕婦Th17比例和Treg細胞失衡,導致母體免疫系統排斥胚胎,影響胚胎發育,最終造成流產。徐彩等[19]進行的動物試驗表明,自擬固胎煎對復發性流產小鼠的治療作用可能與改善免疫平衡及蛻膜環境有關。本研究進一步采用Pearson分析法分析原因不明復發性流產孕婦外周血Foxp3和Th17、Treg、Th17/Treg的關系,結果表明,外周血Foxp3、RANTES水平均與Th17、Th17/Treg呈顯著負相關,與Treg均呈顯著正相關。結合前人研究結果推測Foxp3、RANTES均與機體免疫系統平衡密切相關,Foxp3通過調節多種基因的表達影響Treg的活性,RANTES與相應受體結合后,對CD4+T細胞產生趨化作用,但其中具體作用機制尚不清楚,有待后續深入研究[20-21]。

綜上所述,Foxp3和RANTES水平均與原因不明復發性流產孕婦的免疫平衡失調有關,且二者聯合對原因不明復發性流產的診斷價值較高。但由于本研究例數較少,Foxp3和RANTES對原因不明復發性流產的診斷價值仍需進一步驗證;此外,Th17與炎癥反應關系密切,本研究尚未對兩組研究對象的炎癥因子水平進行比較,有待完善。