變性梯度凝膠電泳技術在馬屬動物腸道微生物多樣性研究中的應用＊

劉驍蒨，尤凡，尹航，馬智超

變性梯度凝膠電泳技術在馬屬動物腸道微生物多樣性研究中的應用＊

劉驍蒨，尤凡，尹航，馬智超

（武漢商學院體育學院 國際馬術學院，湖北 武漢 430056）

馬屬動物腸道微生物在馬匹健康和性能方面都起著至關重要的作用。為了探究馬屬動物腸道微生物多樣性，對變性梯度凝膠電泳技術在馬屬動物腸道微生物多樣性和菌群結構方面的研究進展進行了概述，指出目前常用的分子生物學技術PCR-DGGE技術在分析動物腸道微生物多樣性方面具有快速、精確等優點，表明PCR-DGGE技術是篩選優勢菌株和分離有害菌等的有效手段，該技術為馬屬動物腸道微生物研究奠定了基礎。

變性梯度凝膠電泳；馬屬動物；腸道微生物；菌群多樣性

馬屬動物腸道內存在種類繁多的微生物，這些微生物和動物之間通過復雜的機制調節動物的消化吸收能力。因此，研究馬屬動物腸道微生物的結構，了解微生物和寄主以及微生物間的作用和功能，也為新功能菌株的發現利用提供理論基礎，對維持馬屬動物健康和治療相關疾病具有重要意義。用傳統的方法培養微生物只能培養出一部分菌種，分析出的菌種種類受到限制，其反映出的微生物種類和群落并不準確。近年來，分子生物學技術快速發展，越來越多的新型儀器和手段被用于分析微生物多樣性。其中變性梯度凝膠電泳技術具有檢測率高、分辨率高等優點被迅速應用于馬屬動物腸道微生物的多樣性研究中。

1 馬屬動物腸道微生物種類

馬屬動物腸道中存在著大量的微生物，微生物與宿主屬于互利共生的關系，腸道中的優勢厭氧菌主要有革蘭氏陽性菌、梭菌等，其次還有鏈球菌、大腸桿菌、乳酸桿菌等[1]。乳酸桿菌是十二指腸中的優勢菌群，而回腸中的優勢菌群主要是大腸桿菌和鏈球菌。另外，厭氧纖維素菌群中瘤胃球菌屬在小馬胃腸中屬于優勢地位。動物腸道內的益生菌和腸道黏膜上皮特異性受體結合，形成重要的生物屏障，抵抗致病菌的侵蝕。益生菌在維護動物腸道健康和增強免疫力方面起著重要的作用。

2 馬屬動物腸道微生物的功能

2.1 提高免疫力

有研究證明，缺乏菌的動物腸道粘膜免疫及全身免疫系統都會出現異常，局部和全身淋巴系統也會出現缺陷。動物腸道免疫系統的建立和維持都離不開腸道微生物的存在。正因為有了腸道益生菌才能夠維持免疫系統的正常運作，一旦腸道微生物群落遭到破壞就會提升機體炎癥的發生率。

2.2 增加屏障作用

動物腸道屏障的構建物包括腸道內的物質，如微生物群落、代謝產物、黏液層、粘膜正常微生物菌群和定植抗力、粘膜上皮細胞等。動物腸道內的益生菌定植于腸道腔壁上，是腸道系統的一道強有力的物理屏障，對于動物腸道的健康保駕護航，同時對病原微生物起到了一定的排斥作用，并且對機體產生有益的刺激，促進抗菌物質的生成。

2.3 促進物質的消化吸收

馬屬動物腸道微生物直接影響著動物體內營養物質的消化和吸收。馬屬動物體內不同種類微生物都不斷地發揮著各自的作用，它們能增加動物對小分子物質的吸收，促進動物對能量的吸收和利用。

3 PCR-DGGE技術概述

3.1 PCR-DGGE技術原理

基于聚合酶鏈反應（PCR）的變性梯度凝膠電泳（PCR- DGGE）是一種指紋圖譜分析技術，其原理是利用不同序列的DNA片段在聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳時，其解鏈的溫度不同，將其區分開來。擴增16S rDNA可變區的目的片段，得到等長的雙鏈DNA片段，使其在變性凝膠中進行電泳，因為擴增到堿基對不同，其解鏈所需的聚丙烯酰胺濃度也不一樣，進行電泳時，長度相同但堿基排列不同的DNA片段會停在凝膠的不同位置上，形成不同條帶的圖譜。理論上在精確的條件下（變性劑梯度、電泳時間、電壓等合適），DGGE技術可區分僅有1個堿基區別的DNA片段。

3.2 PCR-DGGE操作方法

使用PCR-DGGE技術分析馬屬動物腸道微生物多樣性的實驗步驟有：首先是動物腸道內樣本的采集，其次提取采集到的樣本的總基因組DNA，接著使用 PCR方法擴增16S rRNA基因的目的片段，再將擴增到的目的片段進行聚丙烯凝膠電泳，隨后取出凝膠用銀離子染色及獲得圖片，將優勢條帶用刀切割下來進行回收，對凝膠電泳圖使用相關軟件進行數據分析。

提取核酸檢測時，首先要提取腸道內樣本中的DNA。學者研究提取總DNA的方法包括酶法、珠磨法及凍融研磨法等。通過比對，劉健華等[2]采用不同方法提取動物的糞便DGGE結果表明，酶法的裂解效果最差，而珠磨法提取糞便細菌核酸的效果最優。

用PCR的方法擴增細菌16S rDNA，利用細菌16S rDNA保守區序列高度一致的特點，設計擴增引物，擴增出不同的細菌菌群，然后再將擴增產物進行變性梯度凝膠電泳PCR-DGGE，區分出不同堿基序列的細菌。

凝膠電泳后進行染色即顯示出指紋圖譜，目前常用的對凝膠進行染色方法是銀染法。銀染法的原理是先使銀離子與核酸結合成復合物，再用還原劑將銀離子還原，即黑褐色的條帶出現在凝膠上。

根據遺傳指紋，對圖譜中條帶使用軟件進行分析，獲得細菌群落的種群關系。電泳條帶的數目反映細菌種類的多少，電泳條帶的濃淡可以反映細菌的密度。對圖譜分析時，常用的指標包括Shannon多樣性參數，可對腸道微生物進行多樣性進行分析。為獲得進一步的信息，可使用種群專一性探針與得到的條帶進行雜交或建立細菌16S rDNA文庫或將條帶切割擴增后測序，從而進行系統發育分析。

4 馬屬動物腸道微生物的研究

目前對于人類、反芻動物、家禽、豬等的腸道微生物已成為學者們的研究熱點，但對于馬屬動物腸道微生物的研究并不多見。糞便作為馬屬動物腸道微生物研究的樣本是切實有效的，并且新鮮糞便中有大量的微生物，但可培養細菌種群卻不多。國內關于馬腸道微生物的研究僅有為數不多的幾個，如伊如格勒圖[3]對蒙古馬和純血馬腸道細菌多樣性進行的研究，證明了馬糞便中存在著大量的細菌微生物，且大部分是不可培養的未知菌種，具有寶貴的遺傳學研究意義。邢振存[4]研究指出蒙古馬和純血馬腸道內真菌種群結構豐富，且兩種馬匹優勢真菌種群不完全一致，菌種幾乎分別屬于子囊菌門、擔子菌門和新麗鞭毛菌門，以子囊菌門含量最多。蒙古馬和純血馬共有菌屬包括胃梨囊霉屬、牛糞盤菌、細齒糞盤菌等。

DOUGAL等[5]對純血馬和矮種馬的腸道微生物多樣性進行研究后，結果顯示同種動物大腸內微生物種群很接近，它們的優勢菌群主要為厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋體菌門、變形菌門和放線菌門。PROUDMAN等[6]通過對馬匹腸道微生物種群結構的研究來判斷馬匹的腸道以及機體的健康狀況。不同飼料對馬匹腸道微生物種類的影響也不一樣，FOMBELLE等[7]研究指出馬屬動物喂養不同的飼料后，其腸道微生物的菌群明顯不同，飼喂大麥的馬匹與飼喂干草的馬匹相比，其盲腸和結腸中的厭氧菌，如乳酸桿菌和鏈球菌均顯著增加，且腸道內纖維素分解菌的群落結構也不相同。

在患病馬匹和健康馬匹腸道微生物的研究中，COSTA等人[8]對6匹健康馬匹與10匹患結腸炎馬匹進行研究表明，利用細菌16S rDNA法獲得的198 748條序列，結果表明健康的馬厚壁菌門含量較高占到68%，其次是細菌占到14%。MORITA等[9]對日本一個馬場飼養的馬匹，使用PCR-DGGE技術檢測了患有腸炎種馬的胃腸道菌群多樣性，研究結果顯示，健康馬匹的胃腸道大腸桿菌數量明顯高于腹瀉馬匹排泄物中大腸桿菌數量，PCR-DGGE技術能夠成為馬屬動物胃腸道群落結構研究的手段。

5 展望

PCR-DGGE技術是一種快速有效分析微生物多樣性的技術手段，該手段是通過PCR擴增等長的目的片段，通過電泳區分不同堿基排列的條帶，每個條帶相當于一種微生物菌群，條帶的明暗可以反映微生物群落的數量。它的優點在于PCR-DGGE技術可以獲得不可培養的微生物多樣性信息，可以分析到的微生物群落數量遠遠的超過了傳統培養方法。目前，在微生物多樣性的研究中PCR-DGGE技術已得到廣泛應用，且將該方法與其他分子生物學手段聯合使用，能夠更全面地分析微生態等方面。近年來，越來越多的研究者也將PCR-DGGE技術應用于腸道微生物的研究上，但人們對馬屬動物腸道微生物的研究卻相對較少。隨著人們生活水平的提高，現代馬業已成為了一種新型產業，而在養馬的過程中，馬屬動物腸道的健康狀況受到日益重視，采用PCR-DGGE技術開展馬屬動物腸道微生物相關研究，通過對其胃腸道內微生物多樣性的測定以及研究飼料等因素對其腸道菌群多樣性的影響，將為馬屬動物的飼養、疾病的治療打下堅實基礎。

［1］KRISTIAN D，COLIN S S，HARRY J F，et al.Bacterial diversity within the equine large intestine as revealed by molecular analysis of cloned 16S rRNA genes［J］.FEMS Microbiology Ecology，2001（38）：141-151.

［2］劉健華，陳杖榴，李云，等.腸道菌群多樣性變性梯度凝膠電泳分析法的建立［J］.中國獸醫科學，35（6）：445-449.

［3］伊如格勒圖.蒙古馬腸道細菌多樣性的研究［D］.呼和浩特：內蒙古農業大學，2015.

［4］邢振存.蒙古馬和純血馬腸道真菌多樣性初步研究及分析［D］.呼和浩特：內蒙古農業大學，2016.

［5］DOUGAL K，DE LA FUENTE G，HARRIS P A，et al.Identification of a core bacterial community within the large intestine of the horse［J］. PloS one，2013，8（10）：e77660.

［6］PROUDMAN C J，HUNTER J O，DARBY A C，et al.Characterisation of the faecal metabolome and microbiome of Thoroughbred racehorses［J］.Equine Veterinary Journal，2015，47（5）：580-586.

［7］DE FOMBELLE A，JULLIAND V，DROGOUL C，et al.Feeding and microbial disorders in horses: 1-Effects of an abrupt incorporation of two levels of barley in a hay diet on microbial profile and activities［J］. Journal of Equine Veterinary Science，2001，21（9）：439-445.

［8］COSTA M C，ARROYO L G，Allen-Vercoe E，et al.Comparison of the fecal microbiota of healthy horses and horses with colitis by high throughput sequencing of the V3-V5 region of the 16S rRNA gene［J］.PloS one， 2012，7（7）.

［9］MORITA H，NAKAJIMA F，MURAKAMI M，et al.Molecular monitoring of the main changes in bacterial floral diversity in the gastrointestinal tract of a thoroughbred foal with catarrhal enteritis by using PCR-DGGE［J］.Journal of Equine Veterinary Science，2007，27（1）：14-19.

劉驍蒨（1983—），女，四川仁壽人，博士，講師，研究方向為運動人體科學。

武漢商學院科學研究項目“速度賽馬馬匹腸道微生物多樣性的研究”（編號：2014A011）

2095－6835（2020）10－0156－02

Q95

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2020.10.070

〔編輯：王霞〕