芒果苷對不同血凝素(HA)亞型流感病毒的抑制作用研究

邱泰坤 安維婕 何紅玉 況凌楓 羅茂丹 蔣立

【摘要】目的：研究芒果苷對不同血凝素（HA）亞型流感病毒吸附及復制過程抑制作用。方法：使用A/Puerto Rico/8/34毒株為骨架，將流感病毒HA基因片段替換為H1、H4、和H7亞型，通過反向遺傳技術(shù)，構(gòu)建不同HA亞型的重組流感病毒。使用定量RT -PCR方法檢測芒果苷在不同給藥方式下病毒復制情況，從而判斷該藥物對不同HA亞型流感病毒的抑制作用。結(jié)果：在病毒吸附過程中加入芒果苷后，使用不合藥物的維持液，病毒的復制拷貝數(shù)不受影響。然而，在含芒果苷的維持液中，病毒復制的拷貝數(shù)明顯低于單純病毒對照組。結(jié)論：芒果苷對不同HA亞型的流感病毒的吸附過程沒有特異性的抑制作用。其作用靶點可能在病毒進入細胞后的復制過程。

【關(guān)鍵詞】芒果苷 流感病毒 血凝素 吸附

一、背景

流行性感冒（influenza，流感）是流感病毒引起的急性呼吸道感染癥候群。引起該病的病毒，可分為甲，乙，丙三型。其中甲型流感病毒由于其抗原經(jīng)常發(fā)生變異，且傳播迅速，極易造成世界范圍的大流行。近年來，有關(guān)抗流感病毒中藥的研究日益增多，從中篩選有效成分已成為當前新藥研發(fā)的一個熱點。

芒果苷（ mangiferin），又名“莞知母寧”，是一種四羥基毗酮的碳糖苷。現(xiàn)代研究表明芒果苷具有抗炎，抗氧化，抗病毒，保肝利膽，免疫調(diào)節(jié)，抗糖尿病、抗腫瘤等多方面作用。芒果苷抗病毒活性也得到了部分驗證。體外實驗研究顯示，芒果苷能夠抑制HIV-1蛋白酶活性，并具有降低皰疹I(lǐng)、II型病毒對宿主細胞的吸附的作用。體內(nèi)試驗研究顯示，芒果苷能夠抑制鴨乙肝病毒感染，且停藥后不易出現(xiàn)反跳現(xiàn)象。在對抗流感病毒方面，芒果苷能夠明顯延長小鼠平均存活時間，具有綜合抑制流感病毒作用。然而這些研究并沒有詳細的闡明芒果苷抗流感病毒的分子機制。本研究將針對流感病毒對宿主細胞的吸附及復制過程，使用A/Puerto Rico/8/34 （HIN1，PR8）毒株為骨架，將流感病毒HA基因片段替換為H1、H4、和H7亞型。通過反向遺傳技術(shù)，統(tǒng)一流感病毒內(nèi)部基因。使用定量RT-PCR方法對病毒繁殖進行定量分析，從而判斷芒果苷對不同HA亞型流感病毒的抑制作用。

二、材料與方法

1.材料

病毒：流感病毒PR8毒株骨架及pHW2000質(zhì)粒由美國St.JudeChildren Research Hospital，Richard Webby教授惠贈。A/Duck/ShanTou/461/2000 （H4N9）HA基因片段由泰國Mahidol University，Pi-laipan Puthavathana教授惠贈。A/Anhui/l/2013 （H7N9）毒株HA基因片段由中國流感中心舒躍龍教授惠贈。

藥物：芒果苷，中國食品藥品檢定研究院。

2.方法

反向遺傳病毒構(gòu)建：分別將不同亞型HA（H1、H4、H7）克隆到pHW-2000質(zhì)粒上，再分別與流感病毒PR8的其他7個基因片段質(zhì)粒，使用TransIT⑩-LTI共轉(zhuǎn)染到聯(lián)合培養(yǎng)的MDCK和HEK-293T細胞中，獲得的重組流感病毒（rgHI-PR8，rgH4-PR8，rgH7-PR8）將進一步在MDCK細胞中進行增殖。

藥物細胞毒性實驗

將MDCK細胞接種于96孔板，加入不同濃度的芒果苷，37℃5%CO2孵育72小時后，使用MTT比色法檢測其對MDCK細胞的毒性，使用Reed-Iuench法計算半數(shù)中毒濃度（TC50）。

病毒感染性測定

將MDCK細胞接種6孔板，病毒行10倍稀釋后接種細胞中，使用微晶纖維素作為覆蓋系統(tǒng)，培養(yǎng)72小時，然后使用10%福爾馬林溶液固定，結(jié)晶紫染色液。一個蝕斑代表一個病毒體的繁殖后代品系，對活性病毒顆粒進行定量。

實時熒光RT-PCR（real-time RT-PCR）試驗

將病毒培養(yǎng)液使用QIAGEN RNeasy Mini Kit對病毒RNA進行提取。使用QuantiTectTM Probe RT-PCR Kit -步法real-timeRT-PCR進行反應(yīng)，反應(yīng)體積為20μI，使用流感RNP基因通用引物進行病毒核酸擴增，上游引物：5-AGA TI'T CCA CCT GCG ACC G一3;下游引物：5-CAG CGG CTC TCT CCA CAA GT一3。以細胞CAPDH基因為內(nèi)對照，上游引物：5-GGT GAA CCT CCC TGTCAA CG-3;下游引物：5-CTC CCT CCT CCA ACA TGC TG-3。反應(yīng)條件為：42。C 5min，95。C lOsec，95。C 5sec，60。C 34sec，共40個循環(huán)。采用相對定量的方法，△△Ct=（待測組目的基因Ct值.待測組內(nèi)參基因Ct值）.（對照組目的基因Ct值.對照組內(nèi)參基因Ct值），相對含量變化=2-△△Ct。

病毒感染與加藥

使用6孔細胞板，分別將重組流感病毒（rgHl-PR8，rgH4 -PR8.rgH7-PR8）以MOI=O.01量與芒果苷0.8mg/ml使用DMEM細胞培養(yǎng)液1ml進行混合，將混合液加入MDCK細胞中，37℃吸附1.5小時，吸去培養(yǎng)液。此時病毒感染的細胞分為兩組，其中一組加入不含芒果苷DMEM維持液2ml進行維持，另一組使用含芒果苷0.8mg/ml的DMEM維持液2ml進行維持。維持72小時后，使用real-time RT-PCR對病毒復制情況進行定量分析。

統(tǒng)計方法

采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析，用平均值±標準差（x+s）表示;兩兩比較用t檢驗，p<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

三、結(jié)果

知母寧不同加藥方式的抗病毒作用

重組流感病毒rgHI-PR8，rgH4-PR8，rgH7-PR8均能在MDCK細胞中進行復制。根據(jù)藥物細胞毒性實驗測得MDCK細胞對芒果苷半數(shù)中毒濃度為2.87mg/ml。本試驗使用中濃度0.8mg/ml進行流感病毒拷貝數(shù)變化觀察。

試驗結(jié)果顯示，所有三個不同HA亞型重組流感病毒在與細胞吸附過程中加入芒果苷后，使用不含芒果苷維持液進行病毒培養(yǎng)（病毒+芒果苷+不含芒果苷維持液），與各自病毒對照組進行比較，病毒拷貝數(shù)不存在統(tǒng)計學差異。然而在使用含芒果苷的維持液培養(yǎng)后，病毒的拷貝數(shù)明顯低于單純病毒組。

四、討論

芒果苷至今仍未被開發(fā)為臨床藥物的原因之一是其藥理作用泛而弱，定位不突出。本研究圍繞流感病毒在細胞中的吸附和復制過程，通過體外實驗觀察了芒果苷的抗流感病毒的作用。

本研究顯示芒果苷對不同HA亞型流感病毒的吸附過程沒有特異性的抑制作用，但由于流感病毒的感染過程還包括膜融合、脫殼、核蛋白復合物入核、基因組的復制、組裝、出芽和釋放等步驟。因此，芒果苷作用的靶點還有待進一步研究。

本研究揭示芒果苷在病毒進入細胞后的復制過程中起到了抑制作用。除了以上提到的病毒自身復制的步驟可能會受到影響外，從宿主細胞層面，芒果苷能對細胞MAPK信號轉(zhuǎn)導通路中ERK、JNK、p38蛋白含量及磷酸化水平的產(chǎn)生影響。由于這些信號通路的活化能夠直接影響流感病毒在細胞內(nèi)的復制。因此芒果苷抗流感病毒的藥理機制也需要考慮其對細胞的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)機制。

根據(jù)上述實驗結(jié)果，可判斷芒果苷對不同HA亞型流感病毒的吸附過程沒有特異性的抑制作用，其作用靶點可能在病毒進入細胞后的復制過程。

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基金資助：貴州中醫(yī)藥大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（貴中醫(yī)大創(chuàng)合字（2019）-53號）。

作者簡介：邱泰坤、安維婕、何紅玉、況凌楓、羅茂丹：在讀本科生。通訊作者：蔣立（1980-），男，土家族，貴州人，課題指導老師，副主任檢驗技師，博士，研究方向：中醫(yī)藥抗病毒。