中藥巖黃連總堿的體外抗菌實(shí)驗(yàn)研究＊

丘倩倩，韋志鵬，吳麗敏，劉怡雯，蒙田秀

中藥巖黃連總堿的體外抗菌實(shí)驗(yàn)研究＊

丘倩倩，韋志鵬，吳麗敏，劉怡雯，蒙田秀

（廣西中醫(yī)藥大學(xué) 賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院，廣西 南寧 530222）

通過體外培養(yǎng)革蘭氏陽性菌和陰性菌，用中藥巖黃連總堿進(jìn)行抑菌和殺菌實(shí)驗(yàn)，測定藥物的最小抑菌藥物濃度（MIC）和最小殺菌藥物濃度（MBC），觀察培養(yǎng)條件對MIC的影響，考察巖黃連總生物堿的體外抗菌作用。結(jié)果顯示，巖黃連總堿對常見的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抑制作用，其中9種菌株有殺菌作用，除銅綠假單胞菌和白色假絲酵母菌外，同時改變培養(yǎng)液的pH和細(xì)菌接種量，不影響測定結(jié)果。實(shí)驗(yàn)表明，巖黃連總生物堿有很好的體外抗菌作用。

巖黃連；總生物堿；體外抗菌；實(shí)驗(yàn)研究

巖黃連（Corydalis saxicola Bunting）來源于罌粟殼紫堇屬植物，是廣西特色藥材，由于藥效近似黃連又長在石縫中或巖石上而得名，因此又叫土黃連、巖連等[1]。巖黃連味苦，性涼，有散瘀消腫、清熱利濕功效，臨床可用于治療肝硬化、肝炎、肝腫瘤及作為輔助治療[2-3]。其主要生長在廣西、貴州、四川、云南等地方，廣西主要分布在桂西、桂西等地[4]。目前已研制了注射液和片劑等中成藥制劑，是臨床治療肝硬化、肝炎、肝癌等特效藥[5-7]。近些年來，國內(nèi)國外對巖黃連研究較多，其化學(xué)成分復(fù)雜，已報道有57種化學(xué)成分，主要是49個生物堿類及8個甾體類成分，并進(jìn)行了多方面巖黃連相關(guān)藥效作用研究。現(xiàn)代藥理研究證明，巖黃連具有抗肝炎病毒、保肝、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、鎮(zhèn)靜及其他藥理作用[8]。探索中藥抗菌藥效的方法有體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)兩大方法，前期對抗菌中藥的研究，多在體外進(jìn)行。體外抗菌實(shí)驗(yàn)是第一步，本項目先從體外抗菌實(shí)驗(yàn)展開，研究中藥巖黃連總生物堿的抗菌作用，為今后的進(jìn)一步研究做鋪墊。

1 試藥與材料

1.1 試藥

巖黃連藥材購于廣西玉林中藥材市場，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院苑敏副教授鑒定為罌粟殼紫堇屬巖黃連。巖黃連總生物堿的提取：用75%乙醇提取，每次加醇量10倍，提取3次，每次提取時間為2 h，合并提取液，濾過，備用。

1.2 試劑

所用實(shí)驗(yàn)試劑：營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂。

1.3 儀器

所用實(shí)驗(yàn)儀器：96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、BKQ-B59L壓力蒸汽滅菌器（山東博科科學(xué)儀器有限公司）、DH-500恒溫培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、10～200 μL微量移液器、0.22 μL一次性無菌超微濾器、一次性無菌培養(yǎng)皿。

1.4 材料

所用實(shí)驗(yàn)材料：革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、糞鏈球菌）、革蘭氏陰性菌（大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌、肺炎克雷伯菌、傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、變形桿菌、白色假絲酵母菌）

2 方法

MIC和MBC測定：將革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、糞鏈球菌）和革蘭氏陰性菌（大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌、肺炎克雷伯菌、傷寒沙門菌、腸炎沙門菌、變形桿菌、白色假絲酵母菌）37 ℃、24 h培養(yǎng)，再將上述菌株接種在營養(yǎng)肉湯，于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃、24 h培養(yǎng)。細(xì)菌計數(shù)用比濁法進(jìn)行，再用肉湯配制為 106 CFU/mL的菌液備用。用肉湯由10%為起點(diǎn)對巖黃連總堿肉湯藥液進(jìn)行連續(xù)二倍梯度稀釋，逐次加入0.2 mL/孔于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。再按0.01 mL/孔單獨(dú)加入濃度為 106 CFU/mL的每種試驗(yàn)菌菌液，且分細(xì)菌和培養(yǎng)基對照孔。先在4 ℃環(huán)境中培養(yǎng)12 h，再于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃、培養(yǎng) 48 h，直接肉眼觀察結(jié)果。若無細(xì)菌生長（不渾濁）孔的最小藥物濃度為MIC。再用無菌蒸餾水依次將各沒有細(xì)菌生長孔的培養(yǎng)物稀釋10倍，吸取0.01 mL接種在普通瓊脂平板上，于普通培養(yǎng)箱37 ℃、培養(yǎng)48 h，以接種區(qū)域無細(xì)菌生長所對應(yīng)的最小藥物濃度為MBC。

培養(yǎng)條件對MIC測定的影響：用表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌，將含有巖黃連總堿肉湯培養(yǎng)液的pH分別調(diào)整到5.7、7.2、8.2，將試驗(yàn)菌液濃度一次調(diào)到104 CFU/mL、106 CFU/mL、108 CFU/mL，測定MIC。

3 結(jié)果

巖黃連總堿對常見的9種革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑制作用，同時，除白色假絲酵母菌和銅綠假單胞菌，對其他9種菌株有殺菌作用，如表1所示。

巖黃連總堿對6種340株腸道感染的臨床分離菌株有一定的殺菌作用，如表2所示。改變培養(yǎng)液條件（pH和細(xì)菌接種量），不影響測定結(jié)果。

4 討論

中藥自古以來在感染性疾病的防治中發(fā)揮了積極的作用，為保障人類的健康起到重大貢獻(xiàn)。近年來，許多研究者對中藥抗菌作用進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)很多中草藥和許多方劑對某些病原菌具有良好的抗菌作用，并將這些中藥或其有效成分制成了制劑[9-12]，用于臨床防治傳感染性疾病，推動了醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)通過測定中藥巖黃連生物堿的體外抗菌作用，發(fā)現(xiàn)其具有良好的廣譜抗菌活性，這給巖黃連生物堿開發(fā)為廣譜抗菌劑提供理論基礎(chǔ)，同時也為中藥抗菌藥物的開發(fā)拓寬新渠道。

表1 巖黃連總堿對常見革蘭氏陽性菌和陰性菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC和MBC（單位：mg/mL）

菌株MICMBC 金黃色葡萄球菌17.870.0 化膿性鏈球菌20.570.0 糞鏈球菌17.870.0 大腸埃希菌35.570.0 銅綠假單胞菌70.0＞300.0 福氏志賀菌16.835.5 傷寒沙門菌35.570.0 腸炎沙門菌16.870.0 肺炎克雷伯菌70.0130.0 變形桿菌70.0130.0 白色假絲酵母菌130.0＞300.0

表2 巖黃連總堿對340株臨床分離細(xì)菌的MIC、MBC（單位：mg/mL）

菌種菌株MIC范圍MIC50MIC90MBC范圍 大腸埃希菌13016.8～70.035.57035.5～130.0 傷寒沙門菌288.4～70.035.57016.8～130.0 腸炎沙門菌2516.8～130.035.513016.8～300.0 福氏志賀菌228.4～70.016.835.516.8～70.0 肺炎克雷伯菌8035.5～300.070300130.0～300.0 變形桿菌5516.8～130.07013035.5～300.0

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典下冊［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2001：1523-1524.

［2］貴州中醫(yī)藥研究院.貴州草藥［M］.貴陽：貴州人民出版社，1970：609-610.

［3］廣西衛(wèi)生廳.廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)［M］.南寧：廣西科技出版社，1990：223-224.

［4］毛宇昂，梁永紅.巖黃連的研究綜述［J］.時珍國醫(yī)國藥，2006，17（4）：630.

［5］ADRIAN J E，POELSTRA K，KAMPSJ A.Addressing live fibrosis with liposomes taegeted to hepatic stellate cells［J］.J Liosome Res，2007，17（3）：205-218.

［6］YIN M F，LIAN L H，PIAO D M，et al.Tetrandrine stimulates the apoptosis of hepatic stellate cells and ameliorates development of fibrosis in a thioacetamide rat model［J］.World J Gastroenterol，2007，13（8）：1214-1220.

［7］李榮華，彭岳，趙鐵建，等.白花丹對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響［J］.世界華人消化雜志，2009，17（12）：1171-1177.

［8］唐超玲，劉平，鄭華，等.巖黃連化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.中藥新藥與臨床藥理，2018，1（29）：104-109.

［9］王成虎，李延萍，李群堂，等.潛陽封髓丹加減治療多重耐藥菌感染反復(fù)發(fā)燒3例［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2017，12（3）：422-425.

［10］梁傳軍，郭秋萍，李建香.中藥加味二仙湯配合抗菌藥物治療女性患者慢性尿路感染的臨床療效評價［J］.抗感染藥學(xué)，2016，13（6）：1433-1435.

［11］蔣錦琴，黃衛(wèi)平，張小賢.中藥結(jié)核丸對結(jié)核分枝桿菌體內(nèi)外抗菌效果的觀察［J］.江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2006，23（6）：521-522.

［12］曾春暉，楊柯，徐明光，等.廣西藤茶總黃酮對金黃色葡萄球菌抗菌機(jī)制研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（10）：249-252.

R284

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2020.09.015

2095－6835（2020）09－0043－02

2018年廣西大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（編號：201813643024）

丘倩倩（1997—），女，廣西來賓人，本科。

蒙田秀（1985—），女，廣西桂林人，碩士，高級實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴幩幮W(xué)研究。

〔編輯：嚴(yán)麗琴〕