HPLC法測定兒童開胃樂中芥子堿硫氰酸鹽含量

王歡歡，白 林，黃曉舞（中國人民解放軍總醫院制劑中心，北京 100853）

兒童開胃樂是解放軍總醫院非標準制劑品種，臨床使用已經超過20余年，質量可靠，療效安全。處方由山楂、雞內金、麥芽、萊菔子等七味中藥組成，適用于喂養不當引起的厭食，感冒引起的食欲不振等，服用后胃口好、體質壯、血色素提高。該制劑現行標準較低，沒有含量測定項，為了更好的控制其內在質量，本研究采用HPLC法對兒童開胃樂中芥子堿硫氰酸鹽含量進行測定，旨在更好地控制其質量。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JA2003型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；MS205DU電子天平（梅特勒-托利多公司）；LC-2030C3D高效液相色譜儀（日本島津公司）；KQ-100DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

兒童開胃樂（解放軍總醫院，批號：190701、190702、190703；規格：10 mL/支）；芥子堿硫氰酸鹽對照品（北京曼哈格生物科技有限公司，批號：B0002909，純度：93.1%）；萊菔子對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121074 - 201304）。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為一級水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗[1]

色譜柱：苯基柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，上海月旭科技股份有限公司）；流動相：乙腈-3%冰醋酸水溶液（12∶88）為流動相；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長為326 nm；進樣量：10 μL；理論塔板數按芥子堿硫氰酸鹽峰計算應不低于5000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取芥子堿硫氰酸鹽對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含15 μg的溶液，混勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取混合均勻的供試品2 g，置于50 mL容量瓶中，加70%甲醇30 mL，混勻，超聲30 min，取出冷卻至室溫，加70%甲醇定容至刻度，搖勻，轉移至50 mL離心管中，8000 r·min-1離心5 min，取上清液，0.45 μm有機濾膜過濾，備用。

2.2.3 萊菔子對照藥材溶液 取萊菔子對照藥材細粉約0.5 g，按“2.2.2”項下方法制成萊菔子對照藥材溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液 取缺少萊菔子藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制成陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

取上述對照品溶液、供試品溶液、萊菔子對照藥材溶液及陰性樣品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結果顯示，供試品中芥子堿硫氰酸鹽與對照品及對照藥材在相同保留時間處有相同色譜峰，峰形良好，與其他組分峰基線分離度較好，且陰性樣品無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A - 芥子堿硫氰酸鹽對照品，B - 萊菔子藥材，C - 供試品，D - 陰性對照；1 - 芥子堿硫氰酸鹽Fig 1 HPLC chromatogramsA - sinapine thiocyanate reference substance, B - semen raphani, C -test sample, D - negative control; 1 - sinapine thiocyanate

2.4 標準曲線的制備

精密稱取芥子堿硫氰酸鹽對照品23.72 mg置20 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為1.10 mg·mL-1，作為貯備液。取貯備液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，作為中間液。分別精密量取中間液0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成芥子堿硫氰酸鹽濃度分別為0.55、1.10、2.21、5.52、11.04、22.08、44.16 μg·mL-1的對照品系列溶液。將上述對照品系列溶液分別進樣10 μL，按照“2.1”項下色譜方法進行高效液相色譜分析，記錄峰面積。以濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得芥子堿硫氰酸鹽回歸方程：Y= 32 242X- 9 679.1，相關系數r= 0.999 9。結果表明，芥子堿硫氰酸鹽在0.55 ～ 44.16 μg·mL-1濃度范圍內，峰面積與濃度呈良好線性關系。

2.5 精密度試驗

取芥子堿硫氰酸鹽對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣5次，記錄峰面積。結果顯示，芥子堿硫氰酸鹽峰面積的RSD為2.30%（n= 5），表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

精密稱取批號為190701的供試品6份，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法處理，平行制備6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果顯示，芥子堿硫氰酸鹽含量為0.033 7%，RSD = 0.30%（n= 6），表明本方法重復性良好。

2.7 方法檢測限與定量限

精密吸取“2.4”項下對照品溶液，加甲醇逐級稀釋，進樣，記錄色譜圖，在信噪比為3∶1時，測得檢測限為0.99 μg·g-1，在信噪比為10∶1時，測得定量限為2.76 μg·g-1。

2.8 回收率試驗

稱取混合均勻的供試品2 g（批號：190701）于50 mL容量瓶，分別精密加入對照品貯備液（1.104 mg·mL-1）490、630、730 μL，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法處理供試品，分別制備成低、中、高3個水平的加標供試品溶液，加標量分別為540.96、695.52、805.92 μg。每個水平制備3份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率，平均回收率為106.08%（RSD=0.71%，n= 9），結果見表1。

2.9 穩定性試驗

將制備好的供試品溶液和對照品溶液，在室溫放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h后分別上機測定芥子堿硫氰酸鹽，供試品溶液和對照品溶液中芥子堿硫氰酸鹽峰面積RSD分別為0.50%和1.50%（n= 5），表明上述溶液在室溫放置8 h內穩定性良好。

表1 回收率測定結果. n = 9Tab 1 Results of recovery tests . n = 9

2.10 樣品中芥子堿硫氰酸鹽含量測定

取三批中試樣品（批號：20190701、20190702、20190703），分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果顯示芥子堿硫氰酸鹽含量分別為0.032 8%、0.032 9%、0.033 4%。

3 討論

3.1 專屬性考察[1]

在含量測定專屬性試驗中，分別制備了萊菔子對照藥材溶液，缺少萊菔子藥材的陰性樣品溶液及空白溶劑按“2.1”項下色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結果顯示，萊菔子對照藥材溶液在與芥子堿硫氰酸鹽對照品色譜峰相應的位置有相同的色譜峰出現，空白溶劑及陰性對照溶液在芥子堿硫氰酸鹽峰位置處無相應色譜峰出現，不干擾本品含量測定。

3.2 提取方法和時間考察[2]

在供試品制備過程中，比較甲醇、50%甲醇、70%甲醇三種提取溶劑，結果顯示70%甲醇提取效果較好。故確定本品溶劑為70%甲醇。同時考察了不同提取時間（20 min、30 min、40 min）對含量的影響，結果顯示超聲30 min時含量高于20 min，超聲40 min與30 min時供試品中芥子堿硫氰酸鹽含量基本一致，故確定本品提取時間為30 min。

3.3 色譜條件的選擇

參照文獻[1,3-6]，選擇乙腈-0.08 mol·L-1KH2PO4溶液為流動相，普通C18色譜柱，通過調整流動相的比例，改變流速等，都未能達到理想的分離效果，對照品峰有拖尾，重現性不好，有時甚至不出峰。分析原因可能是芥子堿硫氰酸鹽在流動相中溶解性不好，樣品中待測組分峰與相鄰雜質小峰未能有效分離。以緩沖鹽為流動相，若使用不當會造成柱壓升高、柱效下降以及化合物保留時間變化等問題。參照《中華人民共和國藥典》（2015年版）一部萊菔子藥材標準，以乙腈-3%冰醋酸水溶液（15∶85）為流動相，采用普通C18色譜柱，通過調整流動相比例，改變流速等也未能達到理想的分離效果，對照品峰有拖尾，樣品中待測組分峰與相鄰雜質小峰未能有效分離，試用苯基柱后，通過調整流動相比例，以乙腈-3%冰醋酸水溶液（12∶88）為流動相，供試品中芥子堿硫氰酸鹽峰與相鄰雜質峰能夠達有效分離且分離度良好。

3.4 系統耐用性考察

為了考察微小變動因素對本品含量測定的影響，調節流速（0.8、1.0、1.2 mL·min-1）、柱溫（30 ℃、35 ℃）及將苯基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，上海月旭科技股份有限公司）更換成另一根苯基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，菲羅門科學儀器有限公司），進行實驗，RSD均符合要求。在測試條件有微小變動時，測定結果基本不受影響。

3.5 含量限度考察

根據上述三批含量測定數據，結合大生產工藝因素及不同批次間藥材含量高低差異，為確保成品質量，暫定兒童開胃樂中芥子堿硫氰酸鹽含量不得少于0.026%。