四川傳統泡菜中乳酸菌分離與鑒定

李玉德，黃慶才

(米易華森糖業有限責任公司，四川攀枝花 617200)

0 引言

四川泡菜是優質中國泡菜的代表[1]，具有鮮、香、嫩、脆和甜的特點。是四川人民餐桌上的一道重要的小菜.傳統的泡菜制作工藝是以新鮮蔬菜為原料，經過擇菜、洗菜、切分與晾干，加食鹽水和老泡菜水，腌漬發酵制作而成，腌漬過程中通過加入食鹽形成高滲環境抑制有害微生物生長，蔬菜表面和老泡菜水中以乳酸菌為主的有益菌在發酵過程逐漸形成優勢[2]，促進泡菜風味的形成.傳統工藝完全依賴經驗，品質不穩定，質量難以保證，且常出現亞硝酸鹽超標、腐敗菌和病源菌引起的食品安全問題.一直以來，泡菜中的亞硝酸鹽問題是消費者密切關注的的食品安全問題[3].亞硝酸鹽能夠使血紅蛋白氧化生成高鐵血紅蛋白，導致低氧血癥，在體內可轉化生成致癌物亞硝胺，導致胃癌、甲狀腺癌等疾病[4-5].傳統泡菜工業生產與家庭制作均存在著發酵周期長、亞硝酸鹽含量不可控等問題.在泡菜發酵前期，細菌的硝酸鹽還原酶將硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽，導致亞硝峰出現.在發酵后期，隨著酸度的升高，乳酸菌中的亞硝酸鹽還原酶和產酸協同可迅速降解亞硝酸鹽，有機酸降解是亞硝酸鹽降解的主要方式[6].在泡菜腌漬過程中進行強化優質乳酸菌，既可以抑制有害菌生長，又可以快速產酸、降解亞硝酸鹽，是提升泡菜品質的重要途徑[7-9].本研究從傳統四川泡菜中分離乳酸菌，對其降亞硝酸鹽、產酸性能進行檢測，篩選產酸能力與降亞硝酸鹽能力強的乳酸菌，從而為工業化生產提供優質乳酸菌.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采用無菌方法，在采用傳統方法制作的優質泡菜中取得泡菜水，密封保存于4℃冰箱，24 h內開展后續實驗.

1.2 實驗藥品

葡萄糖、三水合乙酸鈉、檸檬酸氫二胺、四水磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80、溴甲酚綠、氯化鈉、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鹽酸、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉，均為分析純；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、瓊脂均為生物試劑.

1.3 培養基

1.3.1 MRS液體培養基 葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，三水合乙酸鈉5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，四水磷酸氫二鉀2.0 g，七水硫酸鎂2.0 g，硫酸錳0.05 g，吐溫801.0 mL，調節pH至6.2～6.6，定容至1 000 mL，121℃滅菌20 min.

1.3.2 MRS固體培養基 MRS液體培養基的基礎上，以1 000 mL添加20 g瓊脂，調節pH至6.2～6.6，121 ℃滅菌20 min.

1.3.3 乳酸菌鑒別培養基 在MRS固體培養基的基礎上，另加0.01%溴甲酚綠作指示劑.

1.4 儀器和設備

超凈工作臺(江蘇蘇凈)、高壓滅菌鍋(上海申安)、恒溫培養箱(上海一恒)、紫外可見分光光度計(北京普析)、酸度計(上海雷磁)、電子天平(上海舜宇).

1.5 乳酸菌的分離與純化

將泡菜水解凍后在無菌條件下取1mL于無菌試管中，再用無菌生理鹽水做稀釋梯度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7.用移液槍分別取10-5、10-6、10-7各0.2 mL涂布到乳酸菌鑒別培養基上，再將培養基放置在干燥器中，蓋上蓋子，通過點蠟燭燃燒消耗氧氣，在37 ℃恒溫培養箱中厭氧培養.培養72 h后，取出培養基，挑出讓培養基變色的菌種，用劃線接種法接種到新的乳酸菌鑒別培養基上，如此反復，直到分離純化出純菌落，此時的菌種初步鑒定為乳酸菌，并對菌株進行編號.將篩選出的乳酸菌用劃線法接種到乳酸菌鑒別培養基上，在37 ℃恒溫條件下培養48 h后觀察其菌落在固體培養基中生長情況及形態、大小.

1.6 產酸能力測定

將經過分離、純化的菌種接種到20 mL的MRS液體培養基中，在37 ℃培養箱中恒溫滅氧培養18 h，再以1%的接種量接種到150 mL的液體MRS培養基中，每隔12 h用pH計測pH值.

1.7 降亞硝酸鹽能力檢測

1.7.1 亞硝酸鹽標準曲線 根據參考文獻[10]中的分光光度法，繪制標準曲線如圖1所示，亞硝酸鈉濃度(μg/mL)與吸光度之間的線性方程為y=0.013 8x+0.011 2(R2=0.999 6)，呈良好的線性關系.

圖1 亞硝酸鹽標準曲線Fig.1 standard Curve of Nitrite

1.7.2 乳酸菌的亞硝酸鹽降解率測定 從MRS固體培養基上挑取單菌落接種到20 mL MRS液體培養基中，在37℃恒溫條件下培養18 h(菌種處于對數生長期)，將活化后的菌懸液以1%的接種量接種到100 mL含有20 mgNaNO2(質量濃度為200 μg/mL)的滅菌的MSR液體培養基中，于37 ℃恒溫條件下培養48 h，依據參考文獻5中的分光光度法測定發酵液中的亞硝酸鹽含量(X)，計算亞硝酸鹽降解率.

1.8 分子生物學鑒定

將分離獲得的乳酸菌接種到液體MRS培養基中活化16 h，吸取1.5 mL菌液于1.5 mL離心管中，采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA，冷凍保存，參照文獻[2]擴增細菌16S rDNA，將擴增樣品送上海生工測序.登錄Eztaxon網站(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)將測序結果通過序列比對鑒定.

2 結果與分析

2.1 乳酸菌分離及形態觀察

根據實驗方法1.5分離泡菜水中的乳酸菌，共獲得10株變色明顯的乳酸菌.在乳酸菌分離培養過程中，采用的是乳酸菌鑒別培養基，該培養基是在MRS固體培養基的基礎上添加0.01%的溴甲酚綠，溴甲酚綠為酸堿指標劑，pH=5.4時呈藍綠色，在pH=3.8時呈黃色，pH為4.5時開始有顏色變化.此次分離得到的10株乳酸菌在鑒別培養基中培養72 h后，菌落周圍的藍綠色基本褪去，呈黃色，表明菌落周圍的pH=3.8左右，呈較強的酸性.將分離獲得的菌在37℃恒溫條件下培養48 h后，菌落在固體培養基中生長情況及形態、大小如表1所示.

由表1可知，LAB-1-1、LAB-1-2、LAB-1-5的生長速度最快，LAB-1-3、LAB-1-4、LAB-2-2的生長速度較好，LAB-2-3、LAB-2-5的生長速度最慢，所分離獲得的10株乳酸菌均呈白色、小點狀、光滑及濕潤的菌落形態.

2.2 產酸特性測定

根據實驗方法1.6將分離獲得的10株乳酸菌接種到20 mL MRS液體培養基中，在37 ℃培養18 h,再接種到盛有150 mL液體MRS培養基的500 mL三角瓶中，每隔12 h測定其pH值，結果如表2所示.

由表2可知，在液體培養基中培養12 h后，10株乳酸菌的發酵液的pH值均降至4.5以下，24 h時，除LAB-1-1、LAB-1-5、LAB-2-1的pH大于4以外，其它乳酸菌均低于4，當發酵培養60 h時所有菌株的pH均達到3.8以下，表明分離獲得的10株菌都具有良好的產酸特性，彼此之間的產酸能力差異較小.

2.3 降亞硝酸鹽性能評價

根據實驗方法1.7對10株菌的降亞硝酸鹽能力進行檢測，結果如表3所示.

從表3可知，10株乳酸菌均對亞硝酸鈉具有降解能力，以LAB-1-5的降解能力最強，達到97.8%.蔬菜中含較高濃度的硝酸鹽，尤其是一些根菜類、葉菜類蔬菜的硝酸鹽含量高達1 500 mg/kg左右[11].硝酸鹽在泡菜腌漬發酵過程中可以在一些微生物的作用下還原生成亞硝酸鹽，后者可進一步可轉化生成具有較強的致癌性的亞硝胺，對消費者的身體健康形成潛在的危害.在蔬菜腌漬過程中添加乳酸菌可以促進亞硝酸降解，降低產品中的亞硝酸鹽含量.王英等[12]將具有優良降解亞硝酸鹽性能的植物乳桿菌應用西蘭花莖泡菜制作，發酵9 d時亞硝酸鹽降至0.3 mg/kg以下.于沛等[13]從自然發酵泡菜中篩選得到高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌，在發酵蘿卜生產中應用，產品的亞硝酸鹽含量降至0.5 mg/kg以下.尹禮國等[14]從宜賓芽菜中篩選得到5株產酸能力強的乳酸菌、降亞硝酸鹽能力均在90%以上，應用于低鹽宜賓芽菜制作，可將產品的亞硝酸鹽降至1.5 mg/kg左右.本研究獲得的10株乳酸菌可進一步應用于泡菜生產，檢測其在生產實踐過程中降解泡菜中亞硝酸鹽能力.

2.4 乳酸菌分子生物學鑒定

根據實驗方法1.8對10株乳酸菌進行鑒定，結果如表4所示.

表4 乳酸菌分子鑒定Tab.4 Molecular Identification of Lactic Acid Bacteria

由表3可以得知，10株乳酸菌中9株菌為乳桿菌屬(Lactobacillus)，1株為片球菌屬(Pediococcus).根據Bosshard等[15]提出的16S rDNA序列相似率>99%定義為種，95%～99%可定義為屬的標準，所有10株菌尚不能定義至種，需要進一步開展生理生化代謝特性研究.劉玉凌等[16]從重慶農戶自制老鹽水中分離到一株乳酸菌，經分子生物學鑒定為短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，結合腸膜明串珠菌制備復合發酵劑應用于泡菜制作，可以提高產酸速度，明顯降低亞硝酸鹽峰值，提高食用安全性，感官品質也優于自然發酵的泡菜.為了進一步對分離得到的乳酸菌進行開發應用，需要對它們的生長特性與發酵特性開展研究.

乳酸菌是一類能將糖類化合物轉化生成大量乳酸的細菌的總稱，是一種習慣提法，具有物種多樣性，廣泛應用于食品工業、醫藥產業和農業生產.四川泡菜中的乳酸菌資源豐富，Nguyen等[17]從一種越南發酵蔬菜中分離到881株乳酸菌，其中56.6%為發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)，Xiong等[18]從泡菜水中分離到耐膽鹽、膽酸的植物乳桿菌植物亞種(Lactobacillusplantarumsubsp.Plantarum)，烏日娜等(2014年)[19]從東北酸菜中分離到24株乳酸菌，分別為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、Lactobacilluscurvatus、Lactobacillusparacasei、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides).本研究根據企業生產實踐需求，從四川泡菜中分離獲得的10株乳酸菌分別為乳桿菌屬和片球菌屬，具有較好的產酸、降亞硝酸鹽能力，可進一步開發為具有自主知識產權的生產用菌.在后期研究中，可采集更多的優質樣品分離獲得更多的菌種資源，保障泡菜產品品質與食品安全.

研究發酵食品中的微生物多樣性除了經典的微生物培養方法外，現代分子生物學技術也是重要的手段.微生物培養技術只能獲得環境中的部分微生物信息，為了全面了解四川泡菜的微生態信息，需要采用基于分子生物學技術的免培養技術開展研究.裴樂樂等[20]通過構建16S rRNA基因文庫對4種鹽漬菜細菌群落進行了分析，乳桿菌屬與鹽單孢菌屬(Halomonas)是鹽漬榨菜的優勢屬，乳桿菌屬、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)和鹽單孢菌屬是鹽漬蘿卜的優勢屬，紅桿菌科未分類細菌屬(UnclassifiedRhodobacteraceae)、乳桿菌屬等細菌屬是鹽漬豇豆的優勢細菌屬，紅桿菌科未培養細菌屬(UnclassifiedRhodobacteraceae)、鹽單胞菌屬、海洋桿菌屬(Marinobacter)、需鹽桿菌屬(Salegentibacter)是鹽漬青菜的優勢細菌屬.陳希等[21]采用建立16S rDNA克隆文庫的方法對不同腌漬階段的雪菜的細菌多樣性進行了研究，結果表明，整個腌漬過程中微生物種類豐富，不同時期存在較大差異，腌制初期的優勢菌群為腸桿菌屬(Enterobacter)和歐文菌屬(Erwinia)，發酵中后期以乳桿菌屬的植物乳桿菌為主導.尹禮國等[2]采用PCR-DGGE對不同鹽漬青菜樣品的細菌群落結構進行了分析，乳桿菌屬、魏斯氏菌屬等細菌是主要細菌屬.高通量測序技術是近年來開發的一種高效分子測序技術，在發酵食品微生態研究中得到了廣泛應用.佟婷婷等[23]采用高通量測序技術對泡菜細菌群落結構研究表明乳桿菌屬、魏斯氏菌屬(Weissella)等細菌是主要細菌屬.

3 結論

本研究從四川傳統泡菜中分離得到10株菌，均具有良好的產酸與降亞硝酸鹽性能，其中菌株LAB-1-5的降亞硝酸鹽性能最高(97.8%).經過分子生物學鑒定，9株菌為乳桿菌屬，1株菌為片球菌屬.本研究以企業生產需求為導向，建立了優質乳酸菌分離篩選的方法，對促進企業科技轉型具有重要意義.后期研究中，進一步加強優質樣品采集，以分離獲得更多的菌種資源，保障泡菜產品品質與食品安全.