隴南核桃腐爛病一株伴生細菌的分離與鑒定

王 瀚，卓平清，王讓軍，王明霞

(1.隴南師范高等專科學校農林技術學院/隴南特色農業生物資源研究開發中心，甘肅隴南 742500；2.成縣核桃科技服務中心， 甘肅隴南 742500)

0 引言

甘肅隴南成縣氣候溫潤，林果獨特，是甘肅省乃至我國西部重要的核桃產區之一，被命名為“中國核桃之鄉”.核桃已成為當地的重要經濟林果產業.截止2016年，該縣栽培面積達34.0×103hm2、1 120萬株，堅果產量達21.44×103t[1].核桃產業的快速發展離不開核桃品種的推廣和繁育，但隨著不同地區間不同品種核桃接穗的廣泛交流，病害的傳播速度也隨之加快，病害發生率逐年提升.核桃腐爛病是一種嚴重的危害核桃樹勢的真菌病害，研究表明，該病是一種由殼蕉孢屬(Cytospora)真菌引起的病害，主要靠分生孢子的快速擴散感染樹體，發病范圍較廣，危害極其嚴重[2-3].

諸多研究發現，核桃病害是一類復合型病害.其病原菌除了主要的致病菌之外，尚存在大量其他種類伴生病原菌，它們與主要病原菌一起共同侵染寄主植物.為準確認識并分析核桃腐爛病的傳播途徑及復合侵染模式，控制其蔓延態勢，本研究對其伴生病原菌進行了分離鑒定，以期為核桃腐爛病的綜合防治提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 甘肅成縣索池大草灣村(海拔1 433 m，地理坐標33°29’45”N，105°57’30”E)核桃基地核桃腐爛病病斑部位分離得到.

1.1.2 供試培養基及試劑 LB培養基：蛋白胨10.0 g，NaCl10.0 g，酵母提取物5.0 g，蒸餾水1000 mL，pH為7.0～7.5[4].革蘭氏染色試劑盒購自碧云天試劑公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(SK8255/8256)，所需其他分子生物學試劑均購自上海生工有限公司.

1.2方法

1.2.1 病原菌的分離和培養 野外考察期間，挖開核桃腐爛病表層，以無菌手術刀挖取核心部位，樣本采回后取核心區部分黑色組織，置于無菌水中浸泡10 min后，以接種環蘸取無菌水液后以常規劃線法在LB平板上劃線，劃線后平板倒置培養24 h后，再挑取單菌落分別以劃線法繼續純化，培養后得一白色菌落，具木腐味，命名為HBG.將其涂布于試管斜面上放37 ℃培養條件下培養后，置于4 ℃冰箱保存備用.

1.2.2 病原菌的形態特征研究 取保存好的病原菌后，于30 ℃條件下活化24 h后觀察菌落形態，后以接種環刮取少量菌膜，按常規方法涂片、干燥和固定.先滴加草酸銨結晶紫染液覆蓋涂菌部位，染色1～2 min后傾去染液，水洗至流水無色，之后以盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋1 min，傾去碘液，水洗至流出水無色，最后以95%酒精脫色，之后復染，鏡檢觀察[5].

1.2.3 病原菌生理生化特征測定 不同的細菌具有不同的酶系和不同的生理特性，這些特性可以作為細菌鑒定和分類的重要方法.為準確、快速及微量化鑒定該菌株.菌株HGB的生理生化性質的測定參照文獻[5]的方法進行.

1.2.4 病原菌生長特性測定 不同的環境因素對微生物的增殖具有一定的影響.為進一步研究該病原菌在不同溫度下的生長特性，取配制好的LB液體培養基，以5 mL離心管分裝，接種活化菌液后按照4、10、15、20、25、30、35、40℃設置處理溫度，每個溫度設置3個平行，培養24 h后分別吸取少量菌液測定OD600；為進一步研究pH值對該菌株增殖的影響.取配制好的LB液體培養基，分別調節pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，接種活化菌液后培養24 h測定菌液的OD600；為進一步研究該病原菌的增殖規律，將活化菌液分別接種于LB液體培養基中于25℃恒溫條件下培養48 h，其中每隔2 h測定OD600，并以此值繪制生長曲線.

1.2.5 病原菌16S rDNA基因序列分析 分離到的菌株經純培養后，采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒(SK8255/8256)提取細菌基因組DNA，采用細菌16S rDNA通用引物27F：AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG和1492R：TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T擴增細菌的16S rDNA，將PCR擴增產物回收后送上海生工有限公司測序.測序結果在GenBank數據庫中進行BLAST比對分析.

2 結果與分析

2.1 病原菌HBG菌落形態

該細菌為短桿狀，菌落較小，白色，邊緣整齊，菌落周圍分泌出粘性物質(見圖1).經革蘭氏染色鑒定為革蘭氏陰性菌(G-).隨著培養時間的延長，可聞見木腐味.

2.2 病原菌HBG的生長特性

溫度是生命體存活的最基本環境因素之一.對于細菌而言，其生長溫度范圍有些較寬、有些較窄.但是對于植物病原菌而言，其增殖的溫度范圍一般與其宿主正常生長的溫度范圍保持一致.通過測定溫度對該菌株HBG的影響，發現其最適溫度為25～30 ℃(圖2).pH值決定生物大分子表面的電荷變化，進而影響其活性的變化.對該病原菌而言，其最佳pH值范圍為6.0～8.0，最適值pH值為7.0左右(圖3).生長曲線表明，該病原菌培養12 h后，細菌開始從對數生長期緩慢增至平臺期，36 h后逐漸進入衰退期(圖4).

2.3 病原菌HBG生理生化特征

病原菌Pantoeasp. HBG生理生化結果見表1.該菌株具有運動性、菌株成團、其接觸酶、甲基紅、V-P試驗及吲哚實驗均為陽性.其淀粉及精氨酸分解能力為陰性.經葡萄糖、乳糖、麥芽糖及蔗糖發酵試驗，均呈陽性.這些特征均與Pantoeasp.非常相似[6].

2.4 病原菌HBG的16S rDNA序列分析

以該菌株DNA為模板，利用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，得到長度為1 375 bp的擴增產物(圖5)，將測序結果通過 BLAST (https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/) 進行分析，挑取BLAST 結果中相似菌株，用 Mega 7 軟件進行系統發育樹構建(圖6).發現該菌株與Pantoeasp. NIIST-167(FJ445)聚為一枝，結合形態特征及生理生化特征，確定該菌株屬于Pantoea，命名為Pantoeasp. HBG.

注:M 為 Marker.圖5 病原菌Pantoea sp. HBG 電泳圖Fig.5 Electrophoresis of Phytopathogenic bBacteria Pantoea sp. HBG圖6 病原菌Pantoea sp. HBG的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic Tree of Phytopathogenic Bacteria Pantoea sp. HBG

3 討論

核桃腐爛病是影響核桃產業發展的一種重要的真菌病害，目前認為其發病的主要機理在于影響核桃樹皮層下韌皮部，進而影響到植物根對營養物質的吸收.另外由于腐爛病的發生影響到了核桃樹體對于礦質元素的吸收.研究表明，氣溫及其他病害發生也常常造成核桃腐爛病的發生[7].

對植物病害研究而言，病原的分離及鑒定是至關重要的.但是，由于植物受病害影響的程度不同、病原物分離方法的差異及其鑒定方法的不同，最終導致該病的病原菌的種類存在差異.目前諸多研究表明其病原菌為殼蕉孢屬(Cytospora)，但種類不盡一致.如國內最早的文獻報道病原為CytcosporajuglandicolaEll et Barth，屬于半知菌亞門[8]；黃治民等研究報道為Cytosporajuglandis(DC.) Sacc.[9-10]；馬榮等報道為Cytosporachrysosperma[11]；岳朝陽等人報道為Cytosporasp[2,12-16]，均屬于殼蕉孢屬(Cytospora).張海軍等[17]分離出的菌株鑒定為Phomasp.為莖點霉屬；郭開發等[18]分離鑒定出新疆核桃腐爛病病原為Chrysosperma.

病原微生物侵染植物體通常是復合侵染，其病原存在多樣性.不同的病原菌在侵染過程中扮演的角色是不同的，它們之間存在拮抗作用或協同作用.對于真菌引發的病害，其病原同樣存在多樣性，通常是真菌、細菌甚至植物病毒侵染植物體.這在經濟作物病害研究方面已有相關報道.如張智慧等[19]報道，三七根腐病病原菌除了腐皮鐮孢菌Fusariumsolani、細鏈格孢菌Alternariatenuis、壞損柱孢菌Cylindrocarpondestructans和黃腐病菌Cylindrocarpondidynum等真菌外，也存在一些其他伴生細菌，共同引發三七的根腐病.泛菌屬細菌是一類重要的土壤腐生細菌，三七根腐病中泛菌屬的細菌，占39.33%.經分離鑒定為成團泛菌Pantoeaagglomerans.對核桃而言，成團泛菌的危害程度更甚于黑斑病的病原菌[20].

在本研究中，在核桃腐爛病的病斑部位分離到泛菌屬的細菌(Pantoeasp.).經培養后發現，該菌菌落為白色，呈粘稠狀，具木腐味.該菌在和其他真菌病原侵染核桃莖干時形成粘稠狀、濕潤的液體環境，一方面保證了這種腐生型細菌的快速增殖，另一方面這種腐生環境也給核桃腐爛病的其他病原菌提供了較好的微環境，在核桃腐爛病的發生及蔓延過程中扮演著重要作用.但其具體感染途徑及其扮演的角色尚需進一步研究證實.