米根霉預(yù)處理對(duì)巨菌草與牛糞混合厭氧發(fā)酵特性的影響

駱小玉 涂海蓉 鄒書珍

摘 要 研究利用米根霉將巨菌草預(yù)處理后與牛糞混合發(fā)酵，測定發(fā)酵初始環(huán)境中環(huán)境因子與發(fā)酵酸化階段的環(huán)境因子和微生物群落結(jié)構(gòu)，并分析發(fā)酵初始環(huán)境、發(fā)酵酸化階段環(huán)境因子和微生物群落特征之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明，米根霉預(yù)處理能夠顯著提高巨菌草和牛糞混合發(fā)酵的沼氣產(chǎn)量（P<0.05），并且使日產(chǎn)氣量的峰值及峰值出現(xiàn)的時(shí)間提前，巨菌草被預(yù)處理6 d的總產(chǎn)氣量最高，為17 775 mL，是未經(jīng)預(yù)處理的1.80倍。預(yù)處理使發(fā)酵初始環(huán)境中的還原性糖含量和VFA（揮發(fā)性脂肪酸）含量提高，可緩解酸化階段因pH降低產(chǎn)生的危害。

關(guān)鍵詞 巨菌草;牛糞;厭氧發(fā)酵;米根霉

中圖分類號(hào)：S216.4;X71 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.26.074

當(dāng)前，全球正處在經(jīng)濟(jì)大發(fā)展的時(shí)代，能源被大量消耗，同時(shí)也帶來了巨大的環(huán)境污染問題。能源供應(yīng)和環(huán)境問題成為制約中國社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的兩大挑戰(zhàn)[1]。巨菌草作為能源作物推廣利用，具有廣闊的前景，在我國的循環(huán)農(nóng)業(yè)中占據(jù)重要地位[2]。

但巨菌草木質(zhì)素含量高，直接發(fā)酵可能存在效率低、啟動(dòng)慢等問題[3]。利用能夠產(chǎn)生纖維素酶的微生物對(duì)纖維素類物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理近年來被廣泛應(yīng)用到厭氧發(fā)酵原料的預(yù)處理中。微生物中的絲狀真菌產(chǎn)生的纖維素酶對(duì)纖維素的水解效率高[4]。近年來，有學(xué)者利用米根霉發(fā)酵產(chǎn)生纖維素酶，纖維素底物糖化后又產(chǎn)生有機(jī)酸。米根霉預(yù)處理后對(duì)厭氧發(fā)酵水解和酸化階段可能產(chǎn)生影響，但將米根霉用到厭氧發(fā)酵底物巨菌草的預(yù)處理當(dāng)中，對(duì)厭氧發(fā)酵特性產(chǎn)生怎樣影響，尤其是酸化階段的特性卻很少有人研究。

基于此，利用米根霉對(duì)生長后期巨菌草進(jìn)行預(yù)處理，之后與牛糞進(jìn)行混合厭氧發(fā)酵，測定發(fā)酵過程中纖維素酶活力、還原性糖含量、VFA含量、銨態(tài)氮含量和pH，并且測定發(fā)酵酸化階段的細(xì)菌和古菌的多樣性，探討預(yù)處理對(duì)發(fā)酵系統(tǒng)微生物和理化性質(zhì)的影響。本研究可為拓寬厭氧發(fā)酵原料預(yù)處理方式以及后續(xù)真菌預(yù)處理發(fā)酵原料的研究提供理論基礎(chǔ)，研究結(jié)果可以指導(dǎo)實(shí)踐生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 米根酶擴(kuò)大培養(yǎng)及巨菌草預(yù)處理方法

首先利用PDA培養(yǎng)基對(duì)米根酶進(jìn)行活化處理，制作米根酶擴(kuò)大培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基。將自然晾干的巨菌草（干物質(zhì)含量為89.2%）粉碎成1～2 cm的小段，之后稱取31.39 g（干物質(zhì)為28g）的曬干巨菌草4份備用，每份巨菌草加入150 mL的米根酶發(fā)酵液，隨后將其分別預(yù)處理2 d、4 d、6 d和8 d，及處理D2、D4、D6、D8，每天定時(shí)攪拌，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)施3個(gè)重復(fù)。對(duì)照（CK）為未經(jīng)預(yù)處理的巨菌草秸稈。

1.2 發(fā)酵原料和接種物

巨菌草取自四川省南充市生態(tài)養(yǎng)殖場，該草生長3年，植株高大。牛糞取自四川省南充市生態(tài)養(yǎng)殖場。接種物取自西華師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室以牛糞為底物馴化30 d的沼氣發(fā)酵罐。發(fā)酵方法和發(fā)酵裝置參考鄒書珍和康迪等[3]的研究結(jié)果。

1.3 指標(biāo)測定方法

1.3.1 微生物測定方法

高通量（Illumina Miseq）測序由上海派森諾生物科技有限公司（中國上海）進(jìn)行。使用細(xì)菌通用引物338F和806R擴(kuò)增V3-V4區(qū)，使用Illumina Miseq對(duì)擴(kuò)增子文庫進(jìn)行測序，用www.i-sanger.com對(duì)微生物門至屬進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)分析。

1.3.2 測定項(xiàng)目及方法

采用烘干法測定總固體質(zhì)量、揮發(fā)性固體質(zhì)量、總氮含量、總有機(jī)碳含量，VFA含量的測定方法參考Zou and Kang的相關(guān)研究[5];發(fā)酵過程中纖維素酶活力和還原性糖含量均利用DNS 比色法測定[6]。用智能pH計(jì)（pHs-3CT型）測定發(fā)酵產(chǎn)物中的pH;利用排水法測定每日產(chǎn)氣量。

1.4 數(shù)據(jù)分析與整理

利用Office 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，利用IBM SPSS 21軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用Oringin軟件制作柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣量的影響

如圖1所示，CK（未經(jīng)預(yù)處理）第一次產(chǎn)氣高峰出現(xiàn)在發(fā)酵的第14天，而被米根霉預(yù)處理2 d、4 d、6 d和8 d的處理組的第一次產(chǎn)氣峰值分別出現(xiàn)在厭氧發(fā)酵的第6天、第4天、第8天和第9天。對(duì)照日產(chǎn)氣量最大值為845 mL，被米根霉預(yù)處理8 d日產(chǎn)氣量最高為

1 200 mL。對(duì)照的總產(chǎn)氣量為9 895 mL，米根酶預(yù)處理巨菌草后與牛糞混合厭氧發(fā)酵后產(chǎn)氣量顯著提高。其中巨菌草被米根霉預(yù)處理4 d后與牛糞混合厭氧發(fā)酵的總產(chǎn)氣量最高，為17 775 mL，是CK的1.8倍。經(jīng)米根霉預(yù)處理的處理組日產(chǎn)氣量的第一次產(chǎn)氣高峰提前，發(fā)酵過程中日產(chǎn)氣量最大值增加，總產(chǎn)氣量顯著提高。該研究結(jié)果進(jìn)一步證明了預(yù)處理能夠提高厭氧發(fā)酵的產(chǎn)氣量，與前人研究結(jié)果一致[7]。

2.2 米根霉預(yù)處理對(duì)厭氧發(fā)酵初始環(huán)境因子的影響

厭氧發(fā)酵的發(fā)酵初始環(huán)境受預(yù)處理?xiàng)l件的影響[8]。因此，研究發(fā)酵初始環(huán)境因子的變化特征對(duì)評(píng)估厭氧發(fā)酵過程中環(huán)境因子的變化有重要意義。預(yù)處理后發(fā)酵初始環(huán)境中的纖維素酶活力和還原性糖含量升高。這是因?yàn)榫蘧葜泻心軌虮幻赘估玫奈镔|(zhì)，米根霉的代謝活動(dòng)能夠產(chǎn)生一定的纖維素酶，之后會(huì)分解巨菌草中的纖維素而產(chǎn)生還原性糖，且米根霉能生產(chǎn)淀粉酶和糖化酶將巨菌草中的淀粉等物質(zhì)分解成還原性糖[9]。米根霉將底物發(fā)酵后會(huì)產(chǎn)生游離脂肪酸和氨類物質(zhì)，相應(yīng)的發(fā)酵初始環(huán)境中的VFA含量和銨態(tài)氮含量提高，但酸性物質(zhì)也會(huì)消耗一定的游離銨態(tài)氮，能決定預(yù)處理后發(fā)酵初始環(huán)境的pH值，因此經(jīng)米根霉預(yù)處理后發(fā)酵初始環(huán)境中氨態(tài)氮含量和pH表現(xiàn)出或升高或降低的現(xiàn)象（圖2）。

2.3 預(yù)處理對(duì)厭氧發(fā)酵酸化階段環(huán)境因子的影響