分子生物學技術在家畜血吸蟲病診斷上的應用

李躋

（寧夏永寧縣閩寧鎮農業服務中心銀川 750104）

關鍵字：PCR 技術；診斷；家畜血吸蟲病；應用與推廣

以間接血凝試驗（IHA）為代表的血清學診斷技術逐步在我國家畜血吸蟲病診斷中發揮越來越重要的作用，但其始終作為一種初篩的工具，不能作為確診的依據。以糞便毛蚴孵化為代表的病原學診斷技術是家畜血吸蟲病確診的“金標準”，但隨著流行程度和感染強度的進一步降低，其敏感性飽受詬病。檢測核酸物質的方法為家畜血吸蟲病診斷開辟了新途徑，在特定意義上，核酸檢測也屬于病原學檢測的范疇，可作為家畜血吸蟲病確診的依據。另外，多項研究證實，核酸檢測具有較高的敏感性和特異性。核酸檢測一般基于PCR 技術建立，2002 年，糞便PCR 診斷技術首先應用于檢測曼氏血吸蟲感染，其后，PCR 診斷技術應用不斷增多，并相繼出現診斷日本血吸蟲和埃及血吸蟲病的報道[1]。下面就將基于PCR 及其延伸技術在家畜血吸蟲病診斷上的應用介紹如下：

1 血吸蟲核酸檢測的可行性

只要病原體存在于家畜或受體體內，機體內就會有其核酸物質的存在，日本血吸蟲生活史和寄生部位的特殊性決定了核酸檢測技術的可行性。日本血吸蟲尾蚴侵入家畜皮膚后轉變為童蟲，此后血吸蟲就在家畜的循環系統中移行、發育、成熟和產卵。在上述的過程中，血吸蟲的體被和表膜發生更新、脫落，包括細胞在宿主血液中發生崩解，其核酸物質就持續出現在宿主血液中，有關日本血吸蟲核酸在宿主體內的代謝研究顯示，核酸在進入小鼠體內后，首先分布在血清中，隨后隨血液進入肝臟[2]。PCR 可將微量的靶DNA 特異性地擴增，從而提高了對DNA 分子的分析和檢測的可能性，也相應的提高了檢測的敏感性。目前，從常規PCR 到巢式PCR、實時定量PCR、LAMP 等技術均有在家畜血吸蟲病診斷的報道。

2 現有的核酸分子靶標

診斷靶標的選擇是目前分子生物學診斷技術核心問題，從本質而言對樣本核酸的檢測即為對靶標分子的檢測。下為主要研究的靶標基因或分子。

2.1 核糖體18S rRNA 基因序列

18S rRNA 基因序列長度為1883bp，為血吸蟲看家基因，拷貝數較多，以其為靶標序列先后在日本血吸蟲不同發育階段的動物宿主的多種樣本中檢測到了特異性片段。基于該基因建立起了常規PCR、熒光定量PCR 技術，檢測限可達10fg，并且在感染的早期即可檢測到該靶標，提示18S rRNA 靶序列的診斷價值。

2.2 逆轉錄轉座子SjR2

SjR2 具有高度保守和多拷貝的特點，長3,921bp，在基因組中約有400 個完整拷貝和23,755 個不完全拷貝，分散在整個染色體中，并可在血吸蟲生活史多個階段及動物宿主糞便和血清中檢測到。基于此靶基因建立起常規PCR、熒光定量PCR 及LAMP 法，其敏感性可達到80fg/μL 和0.08fg/μL，并且可在感染早期擴增出特異性條帶，并于治療后一段時間轉陰，除具有診斷價值外還具備療效考核價值。

2.3 線粒體基因

線粒體基因為基因一片段的總稱，因線粒體在日本血吸蟲病進化史上較為保守，基因變異程度較小，有可能具有特異性診斷日本血吸蟲病的價值，尤其用于區別其他物種。目前，常用的線粒體基因有COX1、NADH1 等，以其作為靶標建立的相應PCR 技術檢測限也可達到pg 級別。由于線粒體基因相對保守，其在鑒別診斷與日本血吸蟲親緣關系較近的蟲種時可能存在一定的交叉反應，導致診斷的特異性降低。

2.4 5D 基因

編碼日本血吸蟲毛蚴抗原的5D 基因是最早應用于日本血吸蟲核酸診斷的靶基因。該基因為日本血吸蟲基因組中一重復序列，大小為560bp，以其為目的基因建立的的檢測技術除具備良好的敏感性外，其特異性較高也是該基因的一大優勢。

3 核酸分子檢測技術

PCR 技術是分子生物學技術中發展最快，普及最為迅速，應用最為廣泛的技術之一，目前在經濟較為發達的地區，縣級動物疫病控制部門幾乎都配有PCR 儀。PCR 技術是體外酶促合成特異DNA 的方法，使少量甚至痕量目的基因在體外快速擴增達到檢測級的方法。目前，除用于家畜血吸蟲病診斷外，其已經在越來越多的動物疫病的診斷、檢測中發揮著重要作用，并且在標準PCR 的基礎上，衍生出多種PCR 方法。除常規PCR 外，常見的還有巢式PCR、熒光定量PCR 和環介導等溫核酸擴增（LAMP）[3]。這些方法的發展使動物血吸蟲病的診斷向高敏感、高精度的方向發展。尤其LAMP 技術，其擺脫了PCR技術對于儀器依賴，可用肉眼直接進行結果的觀察。

4 核酸樣品制備及處理方法

在家畜血吸蟲病分子生物學診斷中最常用的樣本為血樣和糞樣。糞樣DNA 作為模板的PCR 檢測方法最早可在感染后3 周出現陽性反應，血樣則可在感染1～2 周后就可有陽性反應，提示分子生物學診斷技術可具有早期診斷的價值。傳統提取糞樣DNA 使用ROSE 法，血樣采取堿裂解法，目的為除去DNA 中的PCR 反應抑制物。現今由于商品化的試劑盒的發展，DNA 提取更加快捷方便，加速了分子生物學技術在基層的應用。

5 討論

高特異性和敏感性是核酸分子技術得到迅速發展的重要因素，其中特異性是評價一種檢測技術的最重要的指標之一。血吸蟲具有許多特異的基因序列，檢測其特異性基因片段與檢獲蟲體具有同樣的診斷價值。分子生物學技術直接針對血吸蟲的DNA 片段，理論上具有高度的特異性，比血清學方法更加可靠、穩定。此外，分子生物學檢測具有早期診斷價值，可在感染的較早期采取相應的措施包括藥物治療，即可減少料肉轉化的經濟損失，又可避免大型家畜產生含蟲卵的糞便持續維持血吸蟲生活史，造成連續的傳播。PCR 產物的生成量是以指數方式增加，能將微量甚至痕量級的待測產物擴增到微克的可檢測級別，這種擴大方式為該類方法的敏感性提供了基礎，但同樣又面臨的敏感性過高帶來的假陽性問題。此外污染也是核酸檢測產生假陽性的重要原因，在實際的操作中，多數的假陽性的出現源于污染原因。目前，雖然基層很多疫控和畜牧獸醫部門具備PCR 檢測的儀器設備，處理大量的現場樣本及隨后的上機檢測需要消耗較長時間，分子生物學試劑費用相對較高等缺點給分子生物學方法在基層的推廣帶來一定的難度，但分子生物學檢測方法是未來發展方向，尤其是家畜血吸蟲病流行程度較低后對精準檢測具有更多的需求。

6 小結

近年來，除在小鼠和兔血吸蟲感染分子生物學檢測外，牛羊血吸蟲病的PCR 檢測的報道逐漸增多，因此早日開發出穩定、高效的適用于牛羊等動物的血吸蟲病核酸分子檢測方法必將提高動物血吸蟲病的診斷水平，從而為動物血吸蟲病的防治和流行病學提供新的方法。