ELI SA檢測技術在豬流感病毒檢測中的應用

郝衛芳

（山西省太原市動物預防控制中心太原 030000）

豬流感是由流感病毒所引起的，在生豬養殖過程中一種常見的急性、傳染性呼吸道疾病，對于生豬養殖的健康水平以及生產性能均有非常大的負面影響。自從本世紀初的甲型H1N1 流感在畜牧養殖中大肆蔓延之后，對于流感病毒的檢測方法開始逐漸受到人們的重視。現階段主要的流感病毒檢測方法有血清學診斷方法、分子生物學檢測方法、量子點生物探針流式免疫技術以及液相芯片技術等，其中血清學檢測方法中的酶聯免疫吸附試驗法（ELISA）是當前流感病毒檢測中最常用的方法之一，ELISA 檢測技術具有靈敏度高、特異性強以及試驗操作相對簡單的優勢，給生豬疾病診斷帶來了很大的便利。

1 ELI SA檢測技術的基本原理

ELISA 檢測技術早在上世紀70 年代開始應用，主要是通過抗原定位酶標抗體的方式進行應用，成為一種測定液體中微量物質的新技術。ELISA 檢測技術的原理主要是通過具有免疫活性的抗原或者抗體通過包被在固態的某種載體上，通過將包被的載體與相應的樣品相結合形成一種具有免疫活性或酶活性的酶標抗原或者抗體物質，再將其與這些具有酶活性的酶標抗原或者抗體物質進行反應后形成結合的復合物，通過下一步的洗滌去除雜質后，通過添加底物以及酶形成呈色反應，通過酶標儀定量或者定性分析，從而進行樣品中物質的檢測[1]。

2 ELI SA檢測技術的分類

ELISA 檢測技術按照不同的檢測目的以及方法進行不同的分類，ELISA 檢測技術可以用于檢測抗原或者抗體，以及固相的抗原或者抗體免疫吸附劑、酶標記的抗原或者抗體結合物等。不同的ELISA 檢測技術中酶反應底物是所必須的試劑，通過根據ELISA 檢測技術中試劑之間的結合方式進行了不同的分類，主要的ELISA檢測技術分類有ELISA 直接檢測法、ELISA 間接檢測法、ELISA 雙抗夾心檢測法、ELISA 捕獲檢測法、ELISA 競爭檢測法等[2]。

3 ELI SA檢測技術在豬流感病毒檢測中的應用

ELISA 在豬流感病毒檢測中的應用主要是通過依靠豬流感病毒純化蛋白作為檢測抗原或者抗體，血凝素（HA）作為豬流感病毒主要的表面抗原，是由HA1 蛋白和HA2 蛋白所組成，其中HA1 是高度進化的抗原或者抗體的結合區域，而HA2 相對而言較為保守，核蛋白NP 同HA2 蛋白相同也較為保守。在豬流感病毒檢測的ELISA 檢測技術中通常有ELISA 間接檢測法、雙抗體夾心ELISA 檢測法、捕獲法抗原ELISA 檢測等。

3.1 ELI SA間接檢測法

ELISA 間接檢測法主要是通過利用酶標記的抗體來檢測與固相載體上抗原所結合的待測抗體的檢測方式，ELISA 間接檢測的方法不但可以有效檢測出豬流感病毒機體抗體水平，還可以準確的區分豬流感疫苗免疫抗體和各種豬流感亞型野毒感染所產生的機體抗體。現階段通過利用H1 亞型豬流感病毒的HA1 純化蛋白作為識別抗原，建立了科學有效的豬流感病毒ELISA 間接檢測技術，通過檢測血清中的豬流感病毒抗體的陽性符合率可以達到85%～95%左右，通過利用H3 亞型的流感病毒中的HA 和HA1 蛋白，將其純化后使用單克隆抗體作為包被的抗原建立了ELISA 間接檢測的方法，對于血清中豬流感病毒的檢出率達到86%～93%左右[3]。有研究學者通過使用H5 亞型的豬流感病毒，以HA1 重組蛋白為基礎建立ELISA 間接檢測的方法，在患病動物血清中豬流感病毒準確檢出率達到94%左右。通過利用H1、H3 以及H9 的亞型豬流感病毒建立基于M2 蛋白多肽抗原的間接ELISA 檢測方法，發現可以有效檢測出血清中多種流感病毒亞型的抗體，準確率可以達到98%以上。間接ELISA 檢測方法的優點在于與包被抗原反應的抗體是不加酶的抗體，該抗體有效保留較高的免疫活性，通過酶標記的另一個二抗抗體可以有效的加強信號傳導，間接ELISA 檢測方法的缺點在于出現交叉反應的可能性比較高[4]。

3.2 雙抗夾心ELI SA檢測方法

雙抗夾心ELISA 檢測方法是通過將已知的抗體吸附到固相載體上后，將待測的抗原與吸附于固相載體的抗體結合后再與酶標記的二抗相結合的方法，這種檢測方式適用于具有至少雙表位的抗原。研究學者通過使用H1 亞型的豬流感病毒中HA 單克隆抗體，初步建立的豬流感病毒的雙抗夾心ELISA 檢測方法，檢測血清樣本中陽性樣本的符合率達到96%左右。通過利用H9 亞型流感病毒的高免血清中的Ig G 作為包被抗體，再使用抗AIV-NP-7B4 單克隆抗體作為雙抗夾心ELISA 檢測方法的二抗，成功建立了豬流感病毒抗原的雙抗夾心ELISA 檢測方法，可以準確迅速的檢出患病動物血清中H9 亞型豬流感致病性病毒。雙抗夾心ELISA 檢測方法的優點在于高度的靈敏性和專一性，同時抗原檢測過程不需要純化，雙抗夾心ELISA 檢測方法的缺點是此方法不適用于小分子半抗原的病毒檢測，同時待檢測的抗原需要擁有至少兩個以上的抗體結合部位[5]。

4 結束語

ELISA 檢測技術具有高度的靈敏性以及較強的特異性，同時具有操作方法簡便、經濟成本相對較低、檢測造成的污染較小以及所需儀器設備常見、便宜等優勢，該項檢測技術缺點有抗原制備純度，抗體制備的含量和純度要求較高、較復雜和困難。另外ELISA技術應用于單克隆抗體的篩選、活性的測定以及制備純化是大海撈針的工作量，也是制約ELISA 檢測技術發展的一個重要瓶頸。未來將通過其他高端技術，精密儀器在ELISA 技術中的發展和應用，將不斷提升ELISA 技術在動物疫病和人類疾病監測和診斷中的應用，將會是未來檢測中不可取代的一項重要技術和手段。