非洲豬瘟熒光定量PCR檢測常見問題分析及注意事項

馮妹玲

（廊坊市廣陽區動物疫病防控中心河北廊坊 065000）

非洲豬瘟熒光定量PCR 檢測實驗，不論是對儀器設備還是技術人員技術操作水平，均是要求較高的實驗。在實驗操作過程中稍有疏忽即可造成實驗失敗。筆者根據近兩年實驗室實際操作非洲豬瘟定量熒光PCR 檢測實驗過程中遇到的問題及注意事項總結如下，僅供參考。

1 影響此實驗結果的因素

1.1 非檢測因素

1）標本：樣本的采集部位、樣品的質量以及樣本的保存方法、保存時間等對實驗結果都有一定的影響；

2）建筑條件（實驗室結構）：實驗室空間結構布局是否合理、是否嚴格分區、是否有通風設備等；

3）管理水平：實驗室是否按照規章制度執行、實驗操作是否嚴格按照操作規范在生物安全柜內完成加樣等與實驗結果是否準確都是密不可分的。

1.2 檢測因素

1）人的因素：實驗員的工作態度、技術水平以及在實際操作過程中的操作習慣等均可造成不同的檢測結果；

2）儀器的因素：儀器設備的穩定性、均勻度、光敏感感應管、加熱退火的模塊和時間、激發燈管的強度、數據分析的難易程度均可影響實驗的結果。例如：溫度模塊：包含最基本的升降溫，要保證溫度模塊的均一性，既不能有邊緣效應，也不能有局部溫度的影響。光學模塊：熒光PCR 反應的過程中每一個循環都要測一次光，測光不論是照相還是掃描，不同儀器都有一定的差別，光學模塊的敏感性要高。軟件模塊：熒光信號采集以后，要用軟件模塊來進行分析，分析不但要人性化，還要準確，不能有故障。個人認為此實驗對儀器設備的精密度要求較高。

2 陽性對照無擴增曲線

1）在實驗過程中如果陽性對照無擴增，首先應確定是陽性對照的問題還是體系的問；

2）反應成分存在漏加現象：加樣過程中樣品加到管壁上；或者是吸取樣品時，吸取量不夠；加樣時應將吸頭尖伸至液面以下，這樣不會出現反應液漏加或少加；

3）確定反應條件是否合適；應嚴格按照試劑說明書操作，在規定的條件下進行反應；

4）試劑保存問題；檢查試劑是否按照說明書條件保存使用，如果保存試劑溫度過高，會使酶的活性下降，從而造成實驗室失敗；

5）儀器是否正常工作或設置：檢查儀器設置是否正確。

3 無擴增曲線或Ct 值出現過晚：Ct>38

3.1 陽性對照

首先確認陽性對照反應是否正常，如果陽性對照正常，應從以下幾方面考慮：

1）病毒含量較低：目的基因低于10～100 個拷貝，或采樣部位病毒含量低；

2）模板降解：樣本保存不當；

3）反應體系中存在PCR 反應抑制劑，如：高鹽、乙醇、苯酚、SDS 和甲酰胺；可能使目標樣本的濃度太低，通常如果模板的起始濃度太低，反應體系中會形成大量的引物二聚體使得引物很快消耗完，從而造成擴增曲線的平臺期很低。出現這種情況必須重新采樣、重新提取核酸或加大模板稀釋倍數重復實驗。

切記：不同試劑盒的陽性對照，或下發的陽性標準物質非本試劑盒靶基因片段，陽性物質不通用。

3.2 試劑盒的保存問題

溫度過高將會導致產品活性下降，應在-20℃以下保存可以長期保持活性。反復凍融導致產品活性下降，每次用量較小時，推薦小體積分裝后-20℃保存。

3.3 程序設置不當

未設置信號采集步驟及熒光信號種類，循環數未正常設置。設置固定的程序模板。

3.4 儀器及耗材問題

儀器加熱模塊問題，不能正常擴增；濾光片發霉，PCR 管蓋或管底被標記遮擋，不能采集熒光或者是使用錯誤的PCR 反應管透光性不夠；應定期對儀器進行校準，此實驗中對任何實驗樣品或試劑，均應采用無菌無酶無熱源的離心管進行試劑的分裝和使用。

4 重復性差

4.1 重復性差的原因主要表現

同一個樣品一次為陰性，一次為陽性；有的樣品重復后，結果相差較大；同一個樣品不同的孔之間數據相差較大；不同的人操作結果不一樣。

4.2 措施

1）加樣體積失準：使用性能較好的移液槍，由于熒光PCR 實驗中加樣的體積都特別小，所以對移液器的精確度要求較高，如果移液器吸取的量不準確就會造成擴大反應體積，將模板做高倍稀釋，以大體積加入反應體系中，造成實驗結果失準；

2）液體加到管壁上：由于加樣的量特別少，在加樣過程中稍不留神就有可能加到管壁上，應快速離心，使液體混勻充分反應；

3）定量PCR 儀不同位置溫度不一致：定期校準儀器；

4）定量PCR 儀不同位置溫度升降不一致：定期校準儀器；

5）模板濃度太低：模板濃度越稀，重復性越差，取不同組織進行試驗；

6）q PCR mix 沒有完全混勻：使用前充分溶解并混勻。

5 可疑的擴增：假陽性

5.1 陰性對照也出現明顯擴增和Ct 值

1）反應體系組分被污染：PCR 反應液污染，會出現檢測的所有樣本為陽性則需要更換新的反應液；如果陰性對照污染，僅陰性對照為陽性需要更換新陰性對照或者水重復實驗；

2）交叉污染：防止交叉污染的措施，應將反應體系在生物安全柜內配制并加樣，最后加入陽性對照，陽性對照使用前進行離心，防止管壁粘連的液體污染移液器，使用帶濾芯的槍頭；

3）取不同組織進行試驗；

4）q PCR mix 沒有完全混勻：使用前請充分溶解并混勻。

5.2 實驗室污染

1）對實驗室進行嚴格的區域劃分，減少氣溶膠污染；

2）隔離污染來源，待污染解除后更換試劑重新試驗；

3）用DNA 祛除劑噴灑。

建議：拿到試劑盒后，將PCR 反應液按18μL分裝至PCR 反應管中，-20℃保存，每次使用取相應的管數進行試驗。可防止反應液的污染和反復凍融引起的試劑降解。

6 參考染料

1）參考染料能夠很好地避免因儀器和用戶所造成的錯誤，對于采用參考染料的儀器，其軟件將惰性染料的熒光信號從靶序列發出的熒光中刪除；

2）ROXTM的強度過高，可導致目標信號返回效果極差，擴增曲線呈鋸齒狀且不連續；

3）關閉ROXTM通道并重新分析標準品和數據，則數據恢復正常。

7 擴增曲線不光滑

1）擴增曲線彎曲、雜亂：可能是由于模板核酸質量較差，含有高鹽、苯酚和乙醇殘余物質。應該去除有問題的反應孔并重新分析標準曲線，重新純化模板，去除模板中存在的潛在抑制物；

2）擴增曲線突然驟降：可能使反應管內留有氣泡，由于溫度升高后氣泡破裂，使儀器檢測到的熒光值突然降低所致。應在進行擴增反應之前仔細檢查反應管內是否有氣泡殘留，最好是在離心機上離心一下再進行擴增反應；

3）擴增曲線斷裂或下滑：可能是基線設置不當，基線的終點值大于Ct 值。應重新設置基線值，減小基線終點，重新分析數據；

4）擴增曲線呈鋸齒狀且不連續：Rox 添加不當，需去掉參比熒光或校正參比染料。

筆者在此實驗操作過程中僅發現以上問題，僅供在一線實驗室工作的小伙伴們參考。切記，做非洲豬瘟定量熒光PCR 檢測實驗時一定要做到：要嚴格按照實驗室質量規程管理，嚴防氣溶膠的產生；要嚴格規范實驗操作，嚴防樣本之間的交叉污染；要特別注意移液器和吸頭引起的交叉污染，必須使用帶濾芯吸頭；要經常使用DNA 祛除劑。相信工作在實驗室一線的小伙伴們都能夠嚴格按照操作規程完成此實驗，愿我們一起為畜牧業發展而努力。