果膠-殼聚糖聚合物用于制備結腸靶向空心膠囊的工藝研究

吳麗，馮敏，尤琳烽*

1(重慶工商大學 環境與資源學院, 重慶, 400067)2(河南牧業經濟學院 食品與生物工程學院, 河南 鄭州, 450011) 3(華南農業大學 食品學院, 廣東 廣州, 510642)

在國內，由于“毒膠囊”事件的連續發生[1]，人們“談藥色變”；在國外，上世紀 90 年代英國曾爆發大規模瘋牛病事件，歐美國家一度“聞牛色變”，作為衍生物的明膠產業也遭受打擊，非明膠空心膠囊的開發也早已提上日程[2-4]。靶向給藥系統，可使藥物遞送或濃集于特定靶部位和靶器官，從而避免藥物作用于全身作用帶來的毒副反應，是最新型的第4代藥物劑型[5]。結腸近端容易發生病變，結腸靶向給藥也是目前研究的熱點，但是目前市場上的結腸靶向空心膠囊還存在一些問題，pH依賴型[6]或時間依賴型[7]結腸靶向膠囊，定位不夠準確；菌群/酶觸發型空心膠囊用明膠膠囊包衣而成，但是包衣所用的材料為偶氮類化合物[8]，存在一定的毒副作用；近年來多糖類化合物開始應用，但是制備工藝復雜，甚至有3層包衣[9]。果膠-殼聚糖聚合物是近期研究的熱點，原料豐富，天然安全，且具有在胃中不被降解，在結腸中可被降解的特性，因此將果膠-殼聚糖聚合物作為結腸靶向空心膠囊的新材料，旨在為果膠-殼聚糖的應用提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卡拉膠，港陽香化集團；淀粉，大米淀粉，江西金農生物科技有限公司；牛血清、胰酶粉(胰蛋白酶≥4 000 U/g)、胰淀粉酶≥3 000 U/g、胰脂肪酶≥7 000 U/g，美國Sigma-Aldrich公司；胃蛋白酶≥3 000 NFU/mg，廣州齊云生物技術有限公司；實驗中所用試劑H3PO4、磷酸鹽、甘油均為分析純。

1.2 儀器與設備

DZF-6 020真空干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；SHB-3水循環式真空泵，西安儀創實驗室儀器設備有限公司；PS 811型外徑千分尺，德國帕斯特集團有限公司；PHS-25酸度計，上海雷磁儀器廠；XMTD-204數顯水浴恒溫振蕩器，常州普天儀器制造有限公司；UV-5 100紫外分光光度計，日本Shimadzu公司；QA-HPZ-30恒溫恒濕培養箱，東莞捷程儀器設備有限公司；空心膠囊模具(1號)，紹興拓普機械有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 果膠-殼聚糖聚合物的制備

在室溫條件下，將果膠溶于水中，制備質量濃度為50 g/L的果膠溶液，將殼聚糖溶于0.3%(體積分數)乙酸水溶液中，制備質量濃度為10 g/L的殼聚糖乙酸溶液，然后將殼聚糖溶液緩慢加入到果膠溶液中，邊加邊攪拌，得到果膠殼聚糖質量比為1∶3的溶液，待反應完全以20 000 r/min的速度勻漿，室溫放置48 h，然后將反應物離心，棄去上清液，反復水洗，離心，得果膠-殼聚糖聚合物。

1.3.2 果膠-殼聚糖結腸靶向空心膠囊的制備

將淀粉溶于水中，攪拌并加熱到70～80 ℃[10]，保持5～8 min使糊化；加入卡拉膠攪拌至溶解完全，再緩慢加入果膠-殼聚糖聚合物，加水稀釋溶液調整膠液濃度，并加入甘油作為增塑劑；最后將溶液在(80±5) ℃加熱20～30 min，攪拌均勻后真空脫氣

用不銹鋼模具將果膠-殼聚糖/卡拉膠/淀粉混合溶液在55～60 ℃條件下蘸膠，模具取出翻轉2圈，使膠液均勻涂抹于模具上，稍冷后將模具置于真空干燥箱中干燥12 h，脫模、切割并加蓋密封。

1.3.3 果膠-殼聚糖聚合物含量對藥物釋放度的影響

卡拉膠質量濃度為20 g/L，膠體總固形物質量濃度為60 g/L，調整果膠-殼聚糖聚合物和淀粉的質量濃度，使果膠-殼聚糖占固形物比例為30%、40%、50%、60%(質量分數)，見表1。按1.3.2方法制備果膠-殼聚糖結腸靶向空心膠囊，考察果膠-殼聚糖聚合物占固形物的比例對膠囊藥物釋放度的影響。

表1 膠囊組成配方Table 1 Composition of capsules

1.3.4 果膠-殼聚糖結腸靶向空心膠囊制備工藝優化

(1)果膠-殼聚糖聚合物的比例對膠囊性能的影響

卡拉膠質量濃度為20 g/L，膠體總固形物質量濃度為60 g/L，調整加入的果膠-殼聚糖聚合物量占膠液總固形物的比例分別為40%、45%、50%(質量分數)，加入2%(體積分數)的甘油作為增塑劑，按1.3.2方法制備果膠-殼聚糖結腸靶向空心膠囊，考察果膠-殼聚糖聚合物占膠液固形物的比例對膠囊水蒸氣透過系數的影響。

(2)甘油含量對膠囊性能的影響

卡拉膠質量濃度20 g/L，果膠-殼聚糖聚合物質量濃度為30 g/L，淀粉質量濃度為10 g/L，調整甘油含量占膠液的體積分數分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，按1.3.2方法制備果膠-殼聚糖結腸靶向空心膠囊，考察甘油含量對膠囊水蒸氣透過系數的影響。

(3)干燥溫度對膠囊性能的影響

卡拉膠質量濃度為20 g/L，果膠-殼聚糖聚合物濃度為30 g/L，淀粉質量濃度為10 g/L，加入2%(體積分數)的甘油作為增塑劑，按1.3.2方法制備果膠-殼聚糖結腸靶向空心膠囊，考察干燥溫度40、50、60、70、80 ℃對膠囊水蒸氣透過系數的影響。

(4)果膠-殼聚糖結腸靶向空心膠囊制備的響應面優化試驗

根據單因素試驗結果，采用響應面軟件Design-Expert 6.0對果膠-殼聚糖聚合物結腸靶向空心膠囊制備條件進行Box-Benhnken優化，設計3因素3水平的響應面試驗，以空心膠囊的水蒸氣透過系數為指標對制備條件進行優化。試驗因素水平編碼如表2所示。

表2 空心膠囊制備工藝參數Table 2 Extraction parameter of the bioactive protein from goat placenta

1.3.5 測定方法

1.3.5.1 體外模擬藥物釋放度的測定

模擬胃液(simulated gastric fluid,SGF)的配制：1 g 胃蛋白酶溶解于100 mL HCl(0.01 mol/L)溶液中，pH 1.5；

模擬小腸液(simulated intestinal fluid,SIF)的配制：1 g胰酶粉溶于100 mL 磷酸鹽緩沖(0.05 mol/L)溶液中，pH 6.8；

模擬結腸液(simulated colonic fluid,SCF)的配制：將SD大鼠麻痹后把結腸從腹部取出，在充氮環境中收集結腸內容物30 g溶于100 mL磷酸鹽緩沖(0.05 mol/L)溶液中，pH 7.8。

以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)為模擬藥物來分析該膠囊的藥物釋放特征。每個膠囊填充25 mg BSA并密封，然后放入裝有模擬胃液的容器中2 h，取出水洗后放入模擬小腸液3 h，之后再次取出水洗后放入模擬結腸液9 h。整個過程溶液放置在37 ℃恒溫水浴鍋中并以100 r/min振蕩，每30 min吸取5 mL模擬液測定1次BSA的含量，同時補足對應的新鮮模擬液5 mL。

溶液中BSA的含量采用紫外分光光度法進行測定。分別配制質量濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL BSA溶液作為標準溶液，在280 nm條件下測定吸光度，繪制標準曲線。測定在t時刻取出的模擬液的吸光度，并根據吸光度計算出BSA的含量，BSA釋放率(RB)的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：Rt，BSA在t時刻的累積釋放量；Mi,BSA的原始質量(25 mg)。

1.3.5.2 水蒸氣透過系數(water vapor permeability,WVP)的測定

參照王靜平[11]采用的杯式法進行測定。

1.3.5.3 膠囊規格尺寸的測定

長度的測定：用游標卡尺測量膠囊帽和膠囊體的長度，精確到0.02 mm。

厚度的測定：用外徑千分尺于被測聚合膜上隨機選5點進行測量，取平均值得膜厚度，精確到0.01 mm。

1.3.5.4 含水量的測定

根據《中國藥典》[12]2010版中含水量的測定方法進行測定。

1.3.5.5 脆碎率的測定

根據《中國藥典》[12]2010版中脆碎率的測定方法進行測定。

1.3.6 數據分析方法

采用SPSS統計軟件進行數據分析，組間均值比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，結果用平均值±標準誤差表示。

2 結果與分析

2.1 果膠-殼聚糖聚合物比例對藥物釋放度的影響

根據表1中的膠囊配方制備膠囊，以BSA作為模擬藥物測定空心膠囊的藥物釋放特性，考察果膠-殼聚糖聚合物比例對藥物釋放度的影響，見圖1。

由圖1可知，在模擬胃液里，4種配方制備的膠囊藥物都沒有釋放；在模擬小腸液中，BSA以緩慢的速度釋放出來，C1樣品釋放率最高，達到53.12%，C2、C3、C4的釋放率分別達到9.89%、6.82%和2.47%，在模擬結腸液中，BSA被快速釋放出來，C1樣品內BSA在第5小時的釋放率達到最高值，為95.08%，C2和C3樣品內BSA在第5.5小時達到最大，釋放率分別為92.46%和93.33%，而C4內BSA最大釋放率為90.93%，發生在第7 h，之后BSA釋放率緩慢下降。因此，果膠-殼聚糖聚合物占膠液中固形物的最佳比例為40%～50%。

圖1 BSA體外模擬釋放率Fig.1 Release of BAS from capsule in vitro

2.2 果膠-殼聚糖結腸靶向空心膠囊工藝優化

2.2.1 果膠-殼聚糖聚合物含量對膠囊水蒸氣透過系數的影響

由圖2可知，隨著果膠-殼聚糖聚合物含量的增加，膠囊的水蒸氣透過系數逐漸降低，說明果膠-殼聚糖聚合物含量與膠囊的透水氣性有著直接的關系，而卡拉膠和淀粉的的阻水性相對較差，當果膠-殼聚糖聚合物在固形物中的比例(質量分數)增加時，膠囊的阻水性也會增強。

2.2.2 甘油含量對膠囊水蒸氣透過系數的影響

由圖3可知，隨著甘油含量的增加，水蒸氣透過系數呈現出先減小后增加的趨勢，當甘油含量為1%(體積分數)時，水蒸氣透過系數最小，之后隨著甘油含量的增加，水蒸氣透過系數逐漸增加。原因可能是甘油可以很容易地插入到大分子物質之間，從而增強聚合物中的剛性結構，增強了阻水性能；隨著甘油含量的逐漸增加，甘油分子的親水特性增加了聚合膜的含水量，從而使聚合膜的水蒸氣滲透性能增加[13-14]。

圖3 甘油含量對膠囊水蒸氣透過系數的影響Fig.3 Effect of glycerol on the WVP of capsule

2.2.3 干燥溫度對膠囊水蒸氣透過系數的影響

由圖4可知，隨著干燥溫度的增加，水蒸氣透過系數呈現出先減小后增加的趨勢，當干燥溫度為60 ℃時，水蒸氣透過系數最小，之后隨著干燥溫度的增加，水蒸氣透過系數逐漸增加。原因可能是干燥溫度的升高加劇了膠液中大分子聚合物鏈段的運動，從而形成致密度高的立體網狀結構；也可能是加熱改變了膠液中大分子的結構，從而增加了可與其他物質進行作用的氫鍵，聚合膜結構變得致密，從而WVP減小。但是當溫度繼續升高時，大分子聚合物內部的鏈段運動加速，聚合物還未形成均勻立體網狀結構就已經沉積下來，形成氣孔和裂紋從而使WVP增加[15-16]。

圖4 干燥溫度對膠囊水蒸氣透過系數的影響Fig.4 Effect of drying temperature on the WVP of capsule

2.2.4 果膠-殼聚糖結腸靶向膠囊制備工藝的響應面優化

(1)回歸模型建立及方差分析

根據單因素試驗結果確定影響因素及其水平，響應面試驗設計及結果見表3。試驗結果采用Design-Expert 8.0.6軟件進行多元回歸擬合得到水蒸氣透過系數與各因素的二次方程模型。

水蒸氣透過系數與各因素的二次方程模型：

Y=3.28-0.44×A-0.11×B+0.79×C+0.14×A×B+0.50×A×C+0.29×B×C-0.21×A2+0.70 ×B2+1.48×C2

式中：Y，水蒸氣透過系數，g·mm/(m·d·kPa)；A，果膠-殼聚糖聚合物占膠液固形物的質量分數，%；B，甘油占膠液的體積分數,%；C，干燥溫度，℃。

表3 響應面實驗設計及結果Table 3 Experimental values for the optimization of the fermentation conditions by RSM

試驗數據的方差分析結果見表4，所得回歸方程極顯著，且失擬檢驗不顯著，說明回歸模型很理想，用方程擬合3個因素與水蒸氣透過系數之間的關系是可行的的，實驗誤差小，可以用該回歸模型代替試驗真實點對試驗結果進行分析。由回歸方程和方差分析數據可知，回歸方程的一次項3因素(A、B、C)對水蒸氣透過系數有不同程度的影響，因素A、因素C對水蒸氣透過系數影響極顯著(P<0.01)，因素B對產物的免疫活性影響顯著(P<0.05)；回歸方程的二次項A2、B2、C2以及交互項中的AC、BC也對水蒸氣透過系數影響極顯著(P<0.01)，交互項中的AB對水蒸氣透過系數影響顯著(P<0.05)。這表明各因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，而是呈二次關系，且3因素之間存在顯著的交互作用。

表4 響應面方差分析結果Table 4 Statistic analysis for the response surface quadratic model obtained from RSM design

(2)不同獨立變量間響應面立體圖

分別將模型中的果膠-殼聚糖聚合物質量分數、甘油體積分數及干燥溫度其中1個因素固定在中間水平，得到另外2個因素交互作用對水蒸氣透過系數的子模型，并根據模型繪制三維曲面圖，水蒸氣透過系數的響應面及等高線如圖5所示。

圖5 各因素交互作用對空心膠囊水蒸氣透過系數影響的響應面Fig.5 Response surface of interaction of various factors on capsule WVP

利用Design Expert 8.0.6軟件進行分析計算，可得到果膠-殼聚糖結腸靶向空心膠囊的最佳制備條件為果膠-殼聚糖聚合物占膠液固形物的質量分數(A)為50%，甘油占膠液的體積分數(B)為1%，干燥溫度(C)為46 ℃，預測制備的空心膠囊水蒸氣透過系數為2.34 g·mm/(m·d·kPa)。

(3)試驗模型驗證

采用上述優化后的膠囊制備工藝條件，進行驗證試驗，測得水蒸氣透過系數達到2.39±0.12，與預測值2.34誤差在1%以內，說明采用該方法優化得到的膠囊制備工藝條件參數準確可靠，運用試驗建立的數學模型進行預測在實踐中是切實可行的。

2.3 制備的結腸靶向空心膠囊及其性能

采用蘸膠法制備的膠囊如圖6所示，膠囊呈黃白色，透明，表面光滑，無薄頭、癟頭、梅花頭、皺紋等現象。體長，帽長，體外徑和帽外徑分別為(16.60±0.5)、(9.80±0.5)、(6.63±0.5)和(6.91±0.5) mm，含水率為(10.06±0.83)%，脆碎率為0。

圖6 空心膠囊Fig.6 Photo of capsule

3 結論

(1)通過對藥物釋放率的測定，分析了果膠-殼聚糖聚合物比例對藥物釋放度的影響，當其含量占膠液中固形物的比例為40%～50%時，以BSA為模擬藥物，制備的膠囊在模擬胃液里藥物都不釋放，在小腸液中的藥物釋放率為(6.82±0.54)%～(9.89±0.98)%，在結腸液中的藥物總釋放率達到(92.46±1.50)%～(93.33±0.63)%，達到結腸靶向給藥膠囊的要求。

(2)以水蒸氣透過系數為響應指標，對果膠-殼聚糖結腸靶向膠囊的制備工藝和配方進行單因素和響應面分析，得到最佳制備條件為果膠-殼聚糖聚合物占膠液固形物的質量分數為50%，甘油占膠液的體積分數為1%，干燥溫度為46 ℃，在此條件下制備的空心膠囊水蒸氣透過系數為(2.39±0.12) g·mm/(m·d·kPa)，透氣系數差，有利于內容物穩定性的增加，各項指標符合國標要求。

(3)采用本文方法制備的結腸靶向空心膠囊工藝簡單，原料天然，脆碎度更低，但是不如現有膠囊光滑、堅硬，松緊度稍差，需要進一步改進。