微波萃取結合高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法分析測定干制食用菌中汞的形態

熊善波，肖全偉，何鮚，汪佳林，何瀚庭，蘭航

(成都市食品藥品檢驗院，四川 成都，610500)

汞是自然界中一種常見的污染物，在自然界中主要以無機汞和有機汞的形態存在。汞化合物的毒性依賴于其化學形態和濃度，甲基汞是毒性最強的汞化合物之一，并通過食物鏈富集可對人體中樞神經系統造成不可逆的損害[1]。基于汞形態毒性的差異，僅測定食品中的總汞含量已不能滿足評價汞毒性的需求，因此采用高靈敏度的形態分析測定方法測定食品中的汞含量對食品安全具有積極的意義[2]。野生食用菌為一類珍稀名貴的食材，富含蛋白質、氨基酸、多糖、維生素及多種礦物質元素，因其味道鮮美，營養豐富，深受國內外消費者喜愛。野生食用菌重金屬含量與土壤、水分、大氣等生長環境因子具有密切聯系。多數對重金屬 Hg、As、Cd、Pb有很強的富集能力，尤其是汞含量超標問題凸顯，對消費者身體健康造成威脅[3]。因此，研究汞元素的化學形態對正確認識野生菌中汞元素對人體的危害具有重要意義。

目前汞形態分析主要有高效液相-紫外檢測器聯用法(high performance liquid chromatography-ultraviolet ，HPLC-UV)、氣相色譜-質譜法(gas chromatography-mass spectrometry ，GC-MS)、高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法(high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry，HPLC-ICP-MS)、液相色譜-原子熒光光譜法(liquid chromatography - atomic fluorescence spectrometry ，LC-AFS)[4]等方法。但是GC-MS法需要將汞衍生化處理成氣態化合物，經過萃取才可上機測定，過程繁瑣[5]; HPLC-UV 對流動相要求較高，靈敏度較低，不適合低含量的樣品分析;而LC-AFS雖然使用成本較低，但是由于汞燈的不穩定，造就分析時基線漂移，穩定性欠缺。HPLC-ICP-MS 具有檢出限低，精密度高，和分離效果好等優點被廣泛應用[6]。本文采用微波萃取并結合高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用技術，建立了快速、準確測定食用菌中不同形態汞元素的方法，檢測前處理簡單，線性范圍寬，檢出限低，為全面客觀評價野生食用菌中汞元素的危害提供了方法依據和基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃牛肝菌、黑牛肝菌、松茸、青杠菌、黑虎掌菌、黑松露、蔥菌、雞樅菌、羊肚菌、雞菇，四川川野食品有限公司。

1.2 儀器與試劑

iCAP RQ型電感耦合等離子體質譜儀、U3000型HPLC高效液相色譜儀(色譜柱Thermo C18-5 μm, 4.6 mm×150 mm)，賽默飛世爾；超純水儀，德國密理博公司;分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；微波消解儀，安東帕；甲基汞(metHg，(65.5±2.5) μg/g)、乙基汞(etHg，(76.4±2.8) μg/g)、苯基汞(phHg,純度 98.0 %)、二價汞(Hg2+，10 μg/mL)標準物質，國家標準物質中心；乙酸銨(色譜純)、L-半胱氨酸(優級純)、氨水，天津科密歐化學試劑有限公司；甲醇(色譜純)，賽默飛世爾。實驗用水均為去離子水；實驗中所用器材均用25%的HNO3溶液浸泡過夜，去離子水沖凈晾干備用。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

無機汞(Hg2+)標準儲備溶液：取適量標準溶液，用2% HNO3逐級稀釋成質量濃度為10 μg/mL的標準儲備液，避光保存于4 ℃冰箱中[7]。甲基汞(metHg)、乙基汞(etHg)、苯基汞(phHg)標準溶液儲備液：標準溶液分別轉入10 mL容量瓶配制成10 μg/mL的標準溶液(以Hg計)，避光保存于4 ℃冰箱中。混合標準溶液：分別移取無機汞、甲基汞、苯基汞和乙基汞標準儲備液用流動相(20 mmoL/L乙酸銨+1.0 g/LL-半胱氨酸+5%甲醇)逐級稀釋成質量濃度為0.00、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0、50.0 μg/L的汞形態混合標準系列溶液，現用現配。

1.3.2 儀器條件

色譜條件：色譜柱Thermo C18(4.6 mm×150 mm)，5 μL流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，柱溫35 ℃，流動相：5%甲醇+20 mmol/L乙酸銨+1.0 g/LL-半胱氨酸。ICP-MS工作參數：射頻功率1 550 W，采樣深度5 mm，半導體制冷溫度 -5 ℃,檢測器電壓(計數) 1 037.5 V，檢測器電壓(模擬)：-1 787.5 V，冷卻氣流量14 L/min，Hg質量數202，檢測模式KED，采樣錐和截取錐為鉑錐，載氣為≥99.999%高純氬。

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 微波萃取-酸提取

準確稱取制備混勻的樣品約0.5 g于微波消解罐中，加入10 mL 6 mol/L的鹽酸溶液，靜置30 min后在85 ℃、功率為1 000 W的條件下微波消解15 min。冷卻后將提取液轉移到離心管，用少量超純水轉移消解罐的殘渣，逐滴緩慢加入NaOH溶液(6 mol/L)，使樣液pH 為5～7，然后于4 ℃，8 000 r/ min離心15 min。轉移全部上清液于25 mL容量瓶中， 再加入1 mLL-半胱氨酸溶液(25 g/L)，用超純水定容至刻度，最后用0.45 μm濾膜過濾后分析測定[4]，同時做試劑實驗。

1.3.3.2 超聲輔助-酸提取

準確稱取制備混勻的樣品約0.5 g于50 mL塑料離心管中，加入10 mL，6 mol/L的HCl溶液，放置過夜。室溫下超聲水浴提取60 min，期間振搖數次，將提取液轉移到離心管[8-9]。下同微波萃取-酸提取方法。

1.3.3.3 堿-甲醇溶液提取

準確稱取制備混勻的樣品約0.5 g于50 mL 塑料離心管中，加入10 mL 25%氫氧化鉀甲醇溶液，旋渦混勻，于90 ℃水浴2 h，冷卻至室溫后，甲醇補充至10 mL，離心后取其中1 mL用流動相稀釋至10 mL，使用6 mol/L HCl調節pH為5.0～7.0， 0.45 μm濾膜過濾后測定[10-11]，同時做試劑實驗。

1.4 數據處理

所有測量數據均重復測定3次，結果以平均值±標準偏差表示，采用 Origin 8.0 繪圖軟件繪圖,實驗數據采用Excel軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

定量分析汞形態時，汞化合物的提取是關鍵，本文取松茸和牛肝菌為基質比較微波萃取-酸提取、堿-甲醇溶液提取、超聲輔助-酸提取3種不同的汞形態提取方法。通過加標回收實驗(以甲基汞計)比較不同前處理方式的提取效果，見表1。

表1 前處理方式對汞化合物(以甲基汞計)提取率的影響Table 1 Effect of pretreatment methods on extraction rate of mercury compounds (metHg)

由于干制野生食用菌的特殊性，水分含量少，含有豐富的蛋白質、氨基酸、粗纖維、多糖等，特別容易因為樣品前處理方式不當提取不完全，回收率低[12]。通過試驗發現，堿-甲醇溶液提取容易引入復雜成分，干擾測定結果，導致檢測結果不穩定，并且處理過程復雜，而且回收率低；酸提取基體干擾較少，過程簡單，但比較微波萃取-酸提取和超聲輔助-酸提取2種方法，后者因為提取條件相對溫和，無法完全破壞干制食用菌的有機成分，使提取效率和回收率達不到實驗要求。而微波萃取-酸提取方式則能很好的破壞其有機質，回收率為78.7%～109.3%，既節省時間提高了效率又能保證提取效果，因此本實驗用微波萃取-酸提取對樣品進行前處理。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 流動相中甲醇濃度優化

經實驗發現流動相中加入適量的甲醇會改善汞的形態分離效果[13]。實驗研究不同濃度甲醇(2%～10%,體積分數)對分離效果的影響，結果表明,甲醇濃度增加，4種汞形態的保留時間逐漸變小，分析時間變短。儀器響應值也會隨著甲醇濃度的增加變強，但超過5%會使儀器的霧化器的霧化效率，儀器的靈敏度降低。超過8%后會使等離子體熄火。綜合考慮，選擇甲醇濃度為5%(體積分數)。

2.2.2L-半胱氨酸的濃度優化

由于汞元素的特殊性，在測定汞時會有較強的記憶效應，特別是汞形態分析時，目標物在進入檢測器前會通過長的管路，特別容易形成記憶效應[14-15]。通常考慮加入合適的絡合劑避免汞化合物在管路、色譜柱、矩管、采樣錐和截取錐中富集[16]。常見的絡合劑多為含硫化合物，如2-巰基乙醇，L-半胱氨酸，同型半胱氨酸等，考慮L-半胱氨酸的親水性較強，與汞形成的絡合物在C18柱上保留較弱，即可降低記憶效應，又能縮短檢測時間，故實驗選用L-半胱氨酸作為絡合劑[17-18]。形成的試驗發現不加入L-半胱氨酸時，汞形態不能很好地分離，而加入L-半胱氨酸可以正常實現分離。流動相中L-半胱氨酸質量濃度分別為0.4、0.8、1.0、1.2、1.4 g/L時，用20 μg/L的混合標液分別進樣10次，看基線強度變化情況。研究發現L-半胱氨酸質量濃度為1.0 g/L時，分離效果及峰型均有所改善，儀器響應值較好，而且汞的化合物洗脫完全，基本消除汞的記憶效應。繼續增加其用量沒有明顯變化。

2.3 線性范圍及檢出限

用HPLC-ICP-MS分析測定干制野生食用菌中汞的形態，結果表明，方法在1～50 μg/L線性良好，無機汞、甲基汞、苯基汞和乙基汞相關系數分別為0.999 2、0.999 6、0.999 3、0.999 5，甲基汞含量測定的線性方程為y=3 549 345x-806 689，乙基汞含量測定的線性方程為y=3 093 569x+462 418，無機汞汞含量測定的線性方程為y=2 359 142x-756 262，苯基汞含量測定的線性方程為y=2 986 272x+382 461。選擇流動相組成(5%甲醇+20 mmol/L乙酸銨+1.0 g/LL-半胱氨酸)，采用等度洗脫的方式，色譜峰分離效果圖見圖1。根據檢出限的方法，測定無機汞、甲基汞、乙基汞和苯基汞的檢出限。結果見表1。按照前處理方式稱樣量為0.5 g，定容量為25 mL，計算該方法無機汞、甲基汞、乙基汞、苯基汞定量限分別為0.009、0.024、0.018、0.024 mg/kg。

圖1 汞形態分離效果圖Fig.1 Diagram of mercury speciation

表2 MetHg、etHg、phHg、Hg2+方法測定低限 單位:μg/L

2.4 精密度實驗結果

在實際產品中不容易找到同時存在4種汞化合物的樣品，本實驗混合標準溶液(2.0 μg/L)上機進行測試7次，結果見3。甲基汞質量濃度平均值為2.12 μg/L，相對標準偏差為6.1%，乙基汞質量濃度平均值為1.99 μg/L，相對標準偏差為7.5%，無機汞質量濃度平均值為1.92 μg/L，相對標準偏差為9.9%，苯基汞質量濃度平均值為1.90 μg/L，相對標準偏差為5.5%。

表3 精密度實驗 單位:μg/L

2.5 加標回收實驗結果

選取牛肝菌、松茸、羊肚菌3種干制野生食用菌做加標回收實驗，分別向其中添加3個水平(0.04、0.25、0.50 mg/kg)的汞形態混合標準溶液，分析結果見表4。由表可知，4種汞形態的加標回收率分別為81.6%～117.5%， 81.8%～93.6%,83.0%～99.4%，77.5%～92.5%。滿足GB/T 27404—2008標準給定的方法回收率。由此可見，在本實驗選定的實驗條件下，研究選用的儀器條件和實驗方法的可靠性較高。

表4 不同樣品中4種汞形態的加標回收率Table 4 The recoveries of four mercury species in different samples

2.6 標準物質分析測定

用本實驗建立的方法對標準物質GBW10029和Tort-3進行汞化合物測定,驗證方法的準確性，結果見表5，標準物質平行樣測定結果在標準值范圍內，說明在本實驗選定的實驗條件下，研究選用的儀器條件和實驗方法的準確度較高。

表5 標準物質中汞形態的測定結果 單位:mg/kg

2.7 實際樣品的測定

應用本文建立的方法對黃牛肝菌、黑牛肝菌、松茸、青杠菌、黑松露、蔥菌、雞樅菌、羊肚菌、滑子菇、雞菇、黑虎掌菌的干制樣品進行測定(表6)。結果表明,汞的形態主要以無機汞(Hg2+)的形式存在，其中牛肝菌、青杠菌、松茸、雞樅菌、黑虎掌菌含有少量甲基汞，乙基汞、苯基汞均為未檢測。

表6 樣品中不同價態汞的含量 單位:mg/kg

3 結論

HPLC-ICP-MS聯用技術分析測定不同汞形態是目前較為先進的檢測技術。本文通過優化流動相的組成，較好地解決了汞測定時的富集效應和記憶效應。而由于干制食用菌樣品的特殊性，通過比較微波萃取-酸提取、堿-甲醇溶液提取、超聲輔助-酸提取3種不同的汞形態提取方法，最終選擇了借助微波酸萃取的方法。建立了微波萃取結合HPLC-ICP-MS聯用技術測定干制野生食用菌中汞形態的方法，在12 min內實現了甲基汞、乙基汞、無機汞、苯基汞4種汞的形態分離。根據建立的方法和優化的條件，以牛肝菌、松茸、羊肚菌3種基質樣品進行加標回收實驗，四種汞形態的加標回收率分別為81.6%～117.5%，81.8%～93.6%,83.0%～99.4%,77.5%～92.5%，采用標準物質GBW10029和Tort-3驗證了方法的準確性，滿足分析，方法定量限分別為0.009、0.024、0.018、0.024 mg/kg，精密度良好。此方法前處理簡單、樣品提取效率高，分離效果好，準確度高，適用于干制食用菌中汞形態的定量分析,為食用菌中汞形態測定分析研究提供了一種方法依據。