生態(tài)濕地中抗生素抗性基因的污染控制研究*

鄭 吉 郭 莉 劉 揚 周振超 陳 紅 商衛(wèi)純

(1.寧波市生態(tài)環(huán)境科學研究院，浙江 寧波 315012；2.浙江大學環(huán)境與資源學院，浙江 杭州 310058)

生態(tài)濕地是通過人工模擬自然濕地的結(jié)構(gòu)和功能而設(shè)計和建造的濕地，主要由基質(zhì)、植物、微生物等組成，它充分利用物理、化學和生物的三重協(xié)同作用，通過過濾、吸附、沉淀、離子交換、植物吸收和微生物分解等作用來實現(xiàn)對污水的高效凈化[1]。不同類型的生態(tài)濕地對不同污染物的處理能力存在較明顯差異，因此能夠有針對性地處理不同污染物[2-3]。近年來納米材料、個人護理產(chǎn)品、抗生素抗性基因(ARGs)等新型污染物在水體中不斷被檢出。這些新型污染物雖然并沒被列為水質(zhì)監(jiān)測指標，但是已有許多研究表明這些新型污染物在環(huán)境中的富集對人及其他生物將產(chǎn)生健康風險[4-5]。

飲用水水源中ARGs的檢出對飲用水處理工藝提出了更高的要求[6]。生態(tài)濕地雖然已經(jīng)被廣泛證實可有效去除水中有機物、氮、磷、重金屬等污染物[7-8]，但其對ARGs去除效果的相關(guān)研究較少。

寧波某水庫控制集雨面積為259 km2，總庫容為1.198億m3[9]15，目前是寧波市級飲用水源地之一。該水庫生態(tài)濕地依據(jù)原有魚塘改造而成，作為飲用水預(yù)處理工程承擔著流域富營養(yǎng)化防治的任務(wù)[10]4817。本研究以該水庫生態(tài)濕地為研究對象，采用熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)等方法探究了此生態(tài)濕地各模塊出水中8種常見的ARGs(β內(nèi)酰胺類抗性基因blaOXA-48、blaTEM，磺胺類抗性基因sul1、sul2，四環(huán)素類抗性基因tetO、tetW，大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermX、ermB)、一類整合子(intI1)與16S rRNA的控制情況。另外，本研究還探究了該生態(tài)濕地中ARGs與16S rRNA、intI1間的相關(guān)性，為探索生態(tài)濕地對ARGs的去除效果提供數(shù)據(jù)與支撐。

1 材料與方法

1.1 生態(tài)濕地總體布局

寧波某水庫生態(tài)濕地占地4.33 hm2，凈水能力5萬t/d，設(shè)計平均水深為1.2 m，水力停留時間為20 h。該生態(tài)濕地由水杉涵養(yǎng)林生態(tài)溝凈化系統(tǒng)、多級強化生物膜系統(tǒng)、營養(yǎng)鹽集約式植物資源化系統(tǒng)、高效自凈水生態(tài)系統(tǒng)、生態(tài)濾地系統(tǒng)這5個子系統(tǒng)組成，包含15 個濕地模塊。各模塊結(jié)構(gòu)[9]17,[10]4817如表1所示。

表1 生態(tài)濕地各模塊的結(jié)構(gòu)

溪水從堰壩經(jīng)引水管流入生態(tài)濕地，自生態(tài)濕地的A-1流至C-2后分成2股(A線和B線)分別流向C-6和C-8，匯合于D-1， 經(jīng)E-1流入水庫，具體流程見圖1。

注：A線為A-1→B-1→C-1→B-2→C-2→C-3→C-4→B-3→C-6→D-1→E-1；B線為A-1→B-1→C-1→B-2→C-2→C-5→B-4→C-7→C-8→D-1→E-1。

1.2 樣品采集

對生態(tài)濕地各模塊的進出水進行多次采樣，分別于2019年3、6、9月采集16個樣品(包括進水(即原水))的3次平行樣，每個樣品采樣2 L。樣品存放在含有冰塊的采樣箱中低溫保存，并在12 h之內(nèi)完成水樣預(yù)處理。采集樣品時，用便攜式pH計(HQ11d)和溶解氧儀(LDOTM)測定濕地進出水樣品的溫度、pH和溶解氧。

水樣脫氧核糖核酸(DNA)提取的預(yù)處理：采用抽濾方式富集微生物，用0.22 μm濾膜進行真空抽濾。隨后采用FastDNA Spin Kit for soil試劑盒(MP，美國)進行DNA提取。DNA濃度采用微量分光光度儀(ND-1000)測定，置于-85 ℃保存。

1.3 常規(guī)水質(zhì)指標測定

對2019年6月生態(tài)濕地整體進出水樣品進行COD、總氮、總磷、氨氮、總有機碳(TOC)的測定。COD的測定采用酸性高錳酸鉀氧化法，總氮的測定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法，氨氮的測定采用納氏比色法，總磷的測定采用鉬酸銨分光光度法，TOC由TOC分析儀(5000TOCi)測定。

1.4 熒光定量PCR

熒光定量PCR在Bio-rad IQ5熒光定量PCR儀(Bio-Rad IQTM5)中進行。熒光定量PCR反應(yīng)體系放在96孔板中，其中包含7.5 μL SYBR溶液，0.3 μL ROX溶液，0.3 μL摩爾濃度為10 mmol/L的前后引物，4.6 μL超純水，2 μL 10 ng/μL的DNA樣品。引物見表2。反應(yīng)溫度程序為：95 ℃ 預(yù)變性30 s后，進行40個循環(huán)擴增(95 ℃變性5 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后進行55～95 ℃的熔解曲線分析。每個擴增進行3個技術(shù)重復(fù)，并采用空白實驗來排查誤差。基因的絕對豐度由達到熒光閾值時所需的循環(huán)數(shù)對照標準曲線進行計算。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS V22.0軟件進行相關(guān)性分析、差異性分析，P<0.05被認為存在顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 常規(guī)水質(zhì)指標的去除效果

如表3所示，該生態(tài)濕地對營養(yǎng)鹽具有較好的去除效果，總氮和氨氮的去除率最高，分別為51.6%和40.5%，總磷的去除率為37.5%。多級強化生物膜系統(tǒng)和營養(yǎng)鹽集約式植物資源化系統(tǒng)等對氮磷的控制效果較好。此外，COD的去除率為26.2%，TOC的去除率為12.3%，生態(tài)濕地對飲用水源水質(zhì)凈化效果較好。

表2 引物序列

表3 常規(guī)水質(zhì)指標的去除效果

2.2 ARGs的豐度

對生態(tài)濕地各模塊出水中8種常見的ARGs檢測結(jié)果顯示，blaOXA-48、blaTEM、sul1、sul2、tetO、ermX6種ARGs均有不同程度地檢出。水樣中檢出的各類ARGs比例較為相似，其中磺胺類抗性基因sul1、sul2絕對豐度最高，約占總檢出ARGs的81.84%～88.97%，其次為四環(huán)素類抗性基因tetO(約占6.81%～13.68%)，兩者約占總檢出ARGs的92.02%～97.87%，β內(nèi)酰胺類抗性基因blaOXA-48、blaTEM和大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermX絕對豐度較低。磺胺和四環(huán)素類抗生素是較為廣泛使用的藥品，部分研究中也發(fā)現(xiàn)地表水中存在高豐度的磺胺類抗性基因和四環(huán)素類抗性基因[11-12]，這兩類ARGs需要引起關(guān)注。

ARGs的相對豐度為ARGs絕對豐度與16S rRNA的比值，代表著每個細菌中所含的ARGs拷貝數(shù)。生態(tài)濕地中ARGs的相對豐度如圖2所示。該生態(tài)濕地中細菌總體變化不大，16S rRNA絕對豐度在2.19×106～3.50×106拷貝數(shù)/L波動，而ARGs的相對豐度在處理過程中大體呈現(xiàn)下降趨勢，出水中ARGs的相對豐度僅為進水的26.69%。這意味著，攜帶ARGs的細菌在生態(tài)濕地中的比例逐步降低，這可能與生態(tài)濕地內(nèi)增加的微生物群落和非生物物質(zhì)有關(guān)[13]。

圖2 ARGs的相對豐度和16S rRNA的絕對豐度

雖然生態(tài)濕地出水中sul1、sul2、tetO等的絕對豐度低于同類研究對飲用水源的調(diào)查結(jié)果[14]，但ARGs相對豐度仍處于較高水平。這些ARGs排入水庫后隨著基因的垂直和水平轉(zhuǎn)移，其絕對豐度有可能會再次上升，對人體健康造成威脅[15]。因此，需要進一步提升生態(tài)濕地對ARGs的去除能力。

2.3 ARGs的去除效果

圖3顯示的是該生態(tài)濕地A線、B線對4類ARGs的去除情況，采用秩和檢驗來檢驗ARGs絕對豐度的差異性。該生態(tài)濕地能顯著降低磺胺類抗性基因sul1、sul2和四環(huán)素類抗性基因tetO的絕對豐度(P<0.05)。sul1的去除率為73.9%，sul2的去除率為75.9%，tetO的去除率為80.2%。而對β內(nèi)酰胺類抗性基因blaOXA-48、blaTEM和大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ermX的去除效果較差。同類研究表明，生態(tài)濕地對污水中ARGs的去除率基本在87.8%左右[16]，生態(tài)濕地對水環(huán)境中ARGs的控制效果較好。不同水處理系統(tǒng)(曝氣生物濾池、生態(tài)濕地和紫外線消毒)對ARGs去除效果的比較研究中發(fā)現(xiàn)，生態(tài)濕地對ARGs的去除率為90%～99%，曝氣生物濾池的去除率為40%～90%，但紫外線消毒沒有明顯的效果，說明生態(tài)濕地在ARGs去除方面具有優(yōu)勢，可以優(yōu)先成為污水處理廠進一步去除ARGs的處理系統(tǒng)[17]。

生態(tài)濕地A線、B線ARGs的去除規(guī)律較為相似，這可能與A線、B線中所涉及的模塊組成較為相似有關(guān)。而不同生態(tài)濕地模塊對ARGs的去除率不同。高效自凈水生態(tài)系統(tǒng)主要由生態(tài)浮島組成，種植再力花、水生鳶尾、美人蕉、錢幣草，其對ARGs的去除率最高，約為33.9%。水杉涵養(yǎng)林生態(tài)溝凈化系統(tǒng)(14.8%)、多級強化生物膜系統(tǒng)(15.1%)的去除率次之，水杉涵養(yǎng)林生態(tài)溝凈化系統(tǒng)種植水杉、水生鳶尾、錢幣草、苦草、黑藻、伊樂藻，多級強化生物膜系統(tǒng)主要在懸掛彈性掛膜材料里種植高密度再力花、錢幣草、美人蕉、茭草。營養(yǎng)鹽集約式植物資源化系統(tǒng)搭建生態(tài)溝，遴選濕生和水生高等植物進行套作，其對ARGs的去除率約為8.4%。而生態(tài)濾地系統(tǒng)對ARGs無去除效果，反而使ARGs增加了9.4%。這可能是由于生態(tài)濾地系統(tǒng)主要為水洗砂和碎石填裝的三級垂直潛流濾床，種植植物單一。生態(tài)濕地對ARGs的去除可能主要與植物的根基有關(guān)。挺水植物比沉水植物處理效果好，這可能是因為挺水植物生命活動更為旺盛，微生物環(huán)境比沉水植物復(fù)雜，對多種ARGs的削減潛能更大[18]。

圖3 生態(tài)濕地對ARGs的去除效果

2.4 相關(guān)性分析

整合子是一種可以在整合酶的作用下捕獲外源基因盒并在特定的位點進行重組而使之表達的可移動基因元件，同時整合子又可整合到質(zhì)粒上或自身作為轉(zhuǎn)座子的一個組成部分而參與轉(zhuǎn)移，成為環(huán)境中不同菌屬間ARGs傳播的重要途徑[19]。本研究對生態(tài)濕地中的intI1進行調(diào)查，其絕對豐度為6.81×104～2.63×105拷貝數(shù)/L。磺胺類抗性基因sul1、sul2，四環(huán)素類抗性基因tetO與一類整合子intI1之間呈顯著的正相關(guān)性(P<0.05)，R2分別為0.82、0.91、0.93。一類整合子作為可移動基因元件之一，在磺胺類抗性基因、四環(huán)素類抗性基因的傳播中具有重要作用[20]。因此對于水環(huán)境中sul1、sul2及tetO的削減和控制，應(yīng)關(guān)注一類整合子在環(huán)境中的轉(zhuǎn)移行為特征。

3 結(jié) 論

(1) 生態(tài)濕地中磺胺類抗性基因和四環(huán)素類抗性基因絕對豐度較高，約占總檢出ARGs的92.02%～97.87%，β內(nèi)酰胺類抗性基因和大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因較低。

(2) 生態(tài)濕地對磺胺類抗性基因和四環(huán)素類抗性基因去除率高，sul1的去除率為73.9%，sul2的去除率為75.9%，tetO的去除率為80.2%。

(3) 生態(tài)濕地不同模塊對ARGs的去除效果不同，可能與植物種植情況和植物種類有關(guān)。

(4) 生態(tài)濕地中ARGs與intI1之間存在相關(guān)性，ARGs的去除與intI1有關(guān)。