穴位電針刺激對燙傷致大鼠急性肺損傷炎癥指標的影響

王愛群， 殷文慧， 曹拓， 王鵬珍

（1.暨南大學附屬廣州紅十字會醫院麻醉科，廣東廣州 510220；2.暨南大學附屬廣州紅十字會醫院心血管科，廣東廣州 510220；3.暨南大學附屬廣州紅十字會醫院檢驗科，廣東廣州 510220；4.廣州市創傷外科研究所，廣東廣州 510220）

燙傷是一種外科急癥，一般常伴隨著各種難治并發癥。其中，燙傷后肺損傷的發生率遠超過其他器官，占據燙傷并發癥的首位。燙傷后一旦發生急性肺損傷（acute lung injury，ALI），極易進展為急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），若未及時給予有效的處理將會導致多臟器功能的衰竭，是燒傷患者死亡率居高不下的原因之一[1-2]。在臨床上治療急性肺損傷，除機械通氣效果較明確外，尚缺乏較為有效的治療手段。

穴位電針刺激是在中醫理論的基礎上，結合了現代電子科技技術的一種無副作用的治療方法[3]。穴位電針一般由傳統針刺演化而來，通過電針儀器設定各種參數，進行電針治療[4]。研究顯示，針刺預處理能夠抑制急性肺損傷大鼠血漿中IL-1β 的表達[5]。電針足三里穴預處理能抑制肺缺血再灌注損傷小鼠肺水腫的惡化程度[6]，但它的抗炎機制尚未明確。根據中醫經絡學說 “內屬于府藏，外絡于肢節” 的觀點，肺俞穴為肺之背俞穴，具有解表宣肺、清熱理氣的功效，善于治療氣喘、咳嗽等呼吸系統的疾病[7]。另外，足三里穴屬于陽明經，有研究發現，電針刺激足三里可以顯著抑制內毒素引起的肺損傷惡化[8]。文獻報道，電針足三里等穴位可減輕嚴重燙傷致大鼠急性肺損傷，其機制與激活含α7 亞基N 型膽堿能受體介導的膽堿能抗炎通路，抑制肺組織HMGB1的表達有關[9-10]，但電針通過足三里和肺俞穴雙穴位對燙傷急性肺損傷大鼠的影響尚未有研究報道。本研究采用電針刺激燙傷急性肺損傷大鼠肺俞穴與足三里穴兩個穴位，分析穴位電針刺激對燙傷急性肺損傷大鼠各項炎癥指標的影響，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物

健康成年雄性SD大鼠24只，清潔級，體質量300～600 g，購自廣東醫學實驗動物中心，飼養于廣東省農業科學院動物研究所，動物許可證號：SCXK（粵）2018-0002。大鼠于安靜環境中分籠飼養，明暗交替時間12 h，自由飲水和進食，實驗室溫度為18～22 ℃，濕度為40%～70%，大鼠適應性喂養1周后進行實驗。

1.2藥品與試劑

3% 戊巴比妥鈉， 美國Sigma 公 司， 批號：9060-05-3；HBSS - Hank’s 平衡鹽溶液，美國賽默飛世爾公司，批號：14025076；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS），美國賽默飛世爾公司， 批號： 10010023； 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）檢測試劑盒， 美國R&D 公司，批號：MAB3419；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒，美國R&D 公 司， 批 號： RTA00； 白 細胞 介 素6（interleukin-6，IL-6）檢測試劑盒，美國R&D 公司，批號：6000B；一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）檢測試劑盒，美國R&D公司，批號：MAB9502；環氧化酶2（cyclooxygenase 2，COX2）檢測試劑盒，武漢華美公司，批號：CSBE13399r。

1.3主要儀器

ABL90 型血氣分析儀，河北省廊坊市豪邁醫療器械有限公司提供；ELx808 型進口酶標儀，美國伯騰（BioTek）儀器有限公司提供；HANS2100A型疼痛治療儀，南京濟生醫療科技有限公司提供。

1.4動物分組

將24 只健康雄性SD 大鼠隨機分為4 組，即正常組、模型組、穴位電針組、非穴位電針組，每組各6只。

1.5模型制備與治療

取SD 大鼠適應性喂養1 周后進行實驗，除正常組外，其余各組大鼠均制備燙傷模型。實驗前6 h 禁食不禁水，將3 %戊巴比妥鈉按照30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。參考文獻[11]方法，根據Meeh-Rubner 公式，計算大鼠對應體質量下的腹部、背部50%體表面積。參考文獻[10]方法并進行適當改良，將大鼠背部和腹部剃毛，備皮，然后固定于實驗臺上。將大鼠移近加熱純凈水的燒杯，然后，取面積為大鼠體表總面積50%的紗布，將紗布條浸入熱水中，待水溫恒定于99 ℃時，取出紗布，立即平鋪于大鼠擬燙部位，從紗布接觸大鼠皮膚后開始計時30 s，建立燙傷面積超過體表面積50% 的大鼠燙傷模型（Ⅲ度燙傷創面），隨后按照體質量40 mg/kg 立即給予大鼠腹腔注射HBSSHank’s 平衡鹽溶液以防止休克，同時，做好傷口的消毒處理防止感染。實驗過程中，未發生大鼠因燙傷而死亡的情況。

造模后，穴位電針組選取大鼠足三里和肺俞穴，給予電針處理，連續進行1周。大鼠足三里穴位于大鼠雙側膝關節外下方腓骨小頭下5 mm 處；大鼠肺俞穴位于大鼠第3 胸椎下1.5 寸處。將大鼠呈俯臥狀固定于實驗板上，備皮消毒以暴露穴位，使用直徑為0.25 mm 的一次性無菌針灸針（安徽馬鞍山邦德醫療器械有限公司，規格：0.25 mm ×10 mm），直刺進針4 ～6 mm。采用HANS2100A 型疼痛治療儀進行電針刺激，每日1次，每次20 min。選用疏密波，頻率為3/16 Hz，波寬0.2 ～0.6 ms，刺激電流為2 ～3 mA，刺激強度以大鼠四肢出現輕微顫動為準。非穴位電針組選取足三里和肺俞穴周圍，距離穴位1 cm 處的固定部位進行針刺，以相同的參數設置疼痛治療儀，并進行電針刺激。模型組僅造模，不做其他處理。

1.6標本采集與檢測

大鼠制備燙傷模型后，連續治療1 周，以3%戊巴比妥鈉按照體質量30 mg/kg 腹腔注射麻醉大鼠，頸椎脫臼處死大鼠。從大鼠腹中部切開，暴露腹腔，鈍性分離腹主動脈，采集大鼠腹主動脈血2 mL，用血氣分析儀測定動脈血氧分壓（PaO2）和二氧化碳分壓（PaCO2），剩余血樣置于-80 ℃低溫冰箱中凍存，用于檢測血清炎癥因子表達量。快速打開胸腔，留取大鼠肺組織，取左肺中葉組織，10%的中性甲醛溶液固定48 h 后，乙醇脫水，石蠟包埋，制備切片，蘇木素-伊紅（HE）染色后，光鏡下觀察肺組織病理學結果并拍照。將左肺下葉組織用預冷磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，置于液氮罐中速凍后，放置于-80 ℃低溫冰箱中保存備用。

1.7觀察指標與方法

采用酶聯免疫吸附分析（ELISA）測定血清SOD、TNF-α 和IL-6 含量，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，應用酶標儀進行檢測。取出-80 ℃保存的肺組織，充分裂解并離心得到上清，具體操作步驟嚴格按照iNOS 和COX2 試劑盒說明書進行，用酶標儀檢測肺組織裂解液中iNOS和COX2的含量。

1.8統計方法

采用SPSS 21.0 統計軟件對數據進行分析。計量資料采用均數± 標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。所有實驗均重復3次。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠肺組織大體形態和組織病理學比較

肺組織大體形態學觀察結果顯示：與正常組相比，模型組和非穴位電針組大鼠肺組織外觀發白呈皺縮狀，穴位電針組肺組織則呈現充盈飽滿的狀態。

肺組織HE染色病理學觀察結果顯示：正常組大鼠肺泡間隔厚度一致，肺泡上皮細胞分布正常，肺泡腔內未見明顯脫落的上皮細胞及炎細胞。模型組和非穴位電針組大鼠肺泡間隔厚薄不一，肺泡間隔纖維組織增生并有炎細胞浸潤，肺泡上皮脫落，肺泡腔內可見脫落的上皮細胞及多少不等的炎細胞。穴位電針組肺組織病理學表現較模型組和非穴位組減輕。具體結果見圖1。

表明燙傷大鼠肺損傷模型建模成功，穴位電針可修復大鼠肺損傷。

圖1 各組大鼠肺組織大體形態和組織病理學比較（HE染色法，×100）Figure 1 Comparison of the general shape of lung and histopathological features of lung tissues in various groups（by HE staining，×100）

2.2各組大鼠動脈血中PaO2和PaCO2比較

表1結果顯示：模型組大鼠動脈血中PaO2顯著降低，PaCO2顯著升高，與正常組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。穴位電針組大鼠動脈血中PaO2顯著升高，PaCO2顯著降低，與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而非穴位電針組未能顯著改變大鼠PaO2和PaCO2，與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3各組大鼠血清SOD、TNF-α和IL-6水平比較

表2結果顯示：模型組大鼠血清SOD水平顯著降低，與正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；穴位電針組大鼠血清SOD 水平顯著升高，與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。模型組大鼠血清TNF-α 和IL-6 水平均顯著升高，與正常組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；穴位電針組大鼠血清TNF-α 和IL-6 水平均顯著降低，與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。而非穴位電針組未能顯著改變大鼠血清SOD、TNF-α 和IL-6 水平，與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠動脈血中PaO2和PaCO2比較Table 1 Comparison of the rat PaO2 and PaCO2 in various groups （ ± s，p/mmHg）

表1 各組大鼠動脈血中PaO2和PaCO2比較Table 1 Comparison of the rat PaO2 and PaCO2 in various groups （ ± s，p/mmHg）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組穴位電針組非穴位電針組N/只6 6 6 6 PaO2 44.20 ± 1.06 23.00 ± 1.91①46.22 ± 1.77②24.44 ± 0.31 PaCO2 47.79 ± 92.21 84.19 ± 2.04①52.15 ± 2.02②83.99 ± 2.39

表2 各組大鼠血清SOD、TNF-α和IL-6水平比較Table 2 Comparison of the levels of SOD，TNF-α and IL-6 in rat serum in various groups （ ± s）

表2 各組大鼠血清SOD、TNF-α和IL-6水平比較Table 2 Comparison of the levels of SOD，TNF-α and IL-6 in rat serum in various groups （ ± s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組穴位電針組非穴位電針組N/只6 6 6 6 SOD[J/（U·mL-1）]56.21 ± 0.52 32.15 ± 2.15①45.21 ± 3.61②31.47 ± 2.35 TNF-α[ρ/（ng·mL-1）]19.76 ± 0.92 40.21 ± 3.45①21.59 ± 1.98②39.95 ± 0.77 IL-6[ρ/（ng·mL-1）]27.87 ± 7.68 48.55 ± 1.83①34.29 ± 2.27②48.24 ± 3.91

2.4各組大鼠肺組織iNOS和COX2水平比較

表3 結果顯示：模型組大鼠肺組織iNOS 和COX2水平顯著升高，與正常組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。穴位電針組大鼠肺組織iNOS和COX2水平顯著降低，與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而非穴位電針組未能顯著改變大鼠肺組織iNOS 和COX2 水平，與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠肺組織中iNOS和COX2水平比較Table 3 Comparison of the levels of iNOS and COX2 in rat lung tissues in various groups （ ± s）

表3 各組大鼠肺組織中iNOS和COX2水平比較Table 3 Comparison of the levels of iNOS and COX2 in rat lung tissues in various groups （ ± s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組穴位電針組非穴位電針組N/只6 6 6 6 iNOS[ρ/（ng·mL-1）]114.69 ± 9.50 165.68 ± 21.96①90.05 ± 5.53②164.20 ± 7.34 COX2[ρ/（ng·mL-1）]60.38 ± 9.89 126.63 ± 9.65①68.37 ± 7.91②126.36 ± 6.67

3 討論

通過建立急性肺損傷（acute lung injury，ALI）動物模型作為研究對象，并分析各指標變化是研究急性肺損傷發病機制和治療方案的重要方法[13]。電針治療是中醫治療肺炎的重要組成部分[3-4]。本研究采用電針刺激燙傷急性肺炎大鼠肺俞穴與足三里穴2個穴位，以探究穴位電針療法對燙傷所致急性肺損傷大鼠炎癥因子的影響。肺組織大體形態和組織病理學結果顯示，造模大鼠肺組織外觀和病理切片均發生了標志性改變。血氣分析的結果顯示，急性肺損傷模型組大鼠PaO2顯著下降，PaCO2顯著上升，該結果跟急性肺損傷的臨床特征相一致，表明燙傷急性肺損傷模型制備成功。

經穴位電針治療后，燙傷急性肺損傷大鼠血清中TNF-α 和IL-6 水平顯著降低，SOD 水平顯著升高（均P＜0.05），而非穴位電針治療燙傷急性肺損傷大鼠后，與燙傷急性肺損傷模型組大鼠相比較，血清中TNF-α、IL-6 和SOD 水平均未發生顯著變化（均P＞0.05），提示穴位電針可通過抗氧化和炎癥反應減輕肺損傷。TNF-α 可誘導炎癥因子IL-1β 和IL-6 的產生和釋放，從而激活炎癥反應[14]。本研究也證實，經穴位電針治療后iNOS 和COX2水平均降低，穴位電針治療燙傷急性肺損傷大鼠后，肺組織iNOS 和COX2 水平顯著降低（P＜0.05），而電針刺激非穴位部位，燙傷急性肺損傷大鼠肺組織iNOS 和COX2 未發生顯著變化（P＞0.05）。由此可知，電針刺激是通過穴位對急性肺損傷大鼠炎癥因子發揮作用的。iNOS可由TNF-α、LPS 和IL-1β等促炎癥因子誘導表達，進一步產生大量NO，加劇機體炎癥反應和氧化損傷[15]。有研究[16]報道，COX2 在多種組織包括胰腺炎癥反應中起重要作用，肺部炎癥反應一旦啟動，肺損傷即會發生，肺損傷后釋放多種細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6等因子，這些因子可誘導COX2表達及前列腺素E2（PGE2）合成，參與肺的炎性損傷。此外，COX2還可誘導TNF-α等細胞因子的產生而進一步促進肺損傷[17-18]。

足三里穴屬于足陽明胃經腧穴，文獻報道，電針刺激足三里穴位可抑制肺損傷，但具體作用機制尚不清楚[19]。肺俞穴屬于足太陽膀胱經穴，本研究結果顯示，電針刺激大鼠雙側足三里及肺俞穴后，血清TNF-α，IL-6 濃度及肺組織iNOS 和COX2 等炎癥因子含量降低，而血清SOD 活性增加，SOD 作為體內重要的抗氧化酶，具有清除體內氧自由基的能力[20-21]，表明電針治療主要從兩方面來保護肺功能免受傷害：一是降低促發炎癥反應的各類因子的表達；二是促進對抗炎癥反應的抗氧化酶合成增多。

綜上所述，穴位電針刺激可減輕燙傷致大鼠的急性肺損傷，其作用機制可能與下調相關炎癥指標和上調抗氧化酶指標從而抑制炎癥反應有關，本研究為燙傷誘發急性肺損傷的穴位電針防治提供了實驗依據。