黃芩苷緩釋膜應用于重度慢性牙周炎的體外抑菌效果

陳苑， 景向東， 盧惠冰

（廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405）

慢性牙周炎，是由局部牙菌斑引起牙周支持組織進行性破壞的慢性疾病，影響患者生活質量。黃芩，味苦，性寒，入心、肺、膽、大腸經，具有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血的功效，對牙周病抗菌抗炎療效顯著[1-2]。黃芩苷，是黃芩發揮藥效的主要成分，它是黃酮類化合物，色黃、味苦。研究[3-4]表明，黃芩苷既有廣譜抗菌的特點，又有抗常見耐藥菌的優點。本研究針對重度慢性牙周炎的特征，將黃芩的有效成分黃芩苷制作成緩釋膜，體外培養患者齦溝液中的菌群，觀察4種不同含量黃芩苷緩釋膜的體外抑菌效果，為該緩釋膜的口腔臨床應用提供實驗數據參考，現將研究結果報道如下。

1 對象與方法

1.1臨床資料

1.1.1 研究對象 選取自2018 年3 月至2018 年6 月來廣州中醫藥大學第一附屬醫院口腔科就診的重度慢性牙周炎患者20例，其中男12例，女8例，年齡區間48～63 歲，年齡（55.23 ± 4.12）歲，均簽署知情同意書。

1.1.2 納入標準[5]①臨床診斷為重度慢性牙周炎，至少有1 位點牙周袋＞6 mm，附著喪失≥5 mm，X線片顯示牙槽骨吸收超過根長的1/2；②無全身系統性疾病史。

1.1.3 排除標準[5]①3 個月內使用過抗生素者；②伴有因創傷或不良修復體導致的牙周病者；③伴有頜面腫瘤或黏膜病累及牙周軟組織者；④妊娠期或哺乳期婦女。

1.2方法

1.2.1 材料 黃芩苷對照品（粉劑）（北京北納創聯公司，批號：zl-a-018），純度＞98%；聚羧乙烯（廣州偉伯科技有限公司）；聚乙烯醇（斯百全化學有限公司）；羥甲基纖維素鈉（上海吉至生化科技有限公司）。

1.2.2 儀器 SHA-B 恒溫水浴振蕩器（上海比郎儀器公司）；DGG-924BD 電熱恒溫干燥箱（上海森信公司）；ZW36S24W 型紫外線殺菌燈（江蘇巨光光電科技有限公司）；GHP-9080 隔水式恒溫培養箱（上海印溪儀器表有限公司）。

1.2.3 黃芩苷緩釋膜配制 將緩釋膜材料聚羧乙烯5.0 g、聚乙烯醇15.0 g、羥甲基纖維素鈉30.0 g混合后加入適量溫水，水浴加熱溶解，再倒入甘油40 mL攪拌均勻，將混合液均分為4份，然后分別加入黃芩苷粉劑0.5、1.0、1.5、2.0 g，慢慢攪拌均勻，涂膜、烘干、成膜，膜厚度均勻3 mm為成功，再用壓花工具將膜壓成直徑為5 mm的圓形膜片備用。

1.2.4 體外降解實驗 將制備好的緩釋片分別置于37 ℃9.0 g/L 氯化鈉注射液中，每天定時取出緩釋膜1次，洗滌、干燥至質量無變化后作記錄。

1.2.5 體外抑菌試驗

1.2.5.1 齦溝液采集 患者經過基礎齦上潔治、齦下刮治及根面平整治療后1 周，將40#滅菌紙尖置入牙周袋袋底處，靜止30 s取出，將紙尖立即放入標記好的無菌EP 管（含1 mL 磷酸鹽緩沖液）中。取樣采集一個位點一根紙尖，分別為唇頰、舌側的近、遠中軸角處，4位點/牙，然后快速放入冰箱儲存備用。

1.2.5.2 細菌復蘇與培養 將EP 管內滅菌試紙中齦溝液細菌接種于斯氏血液瓊脂，于37 ℃厭氧環境中培養48 h后備用。

1.2.5.3 瓊脂擴散法 參照紙片擴散法，取已制備好的4種含量的黃芩苷緩釋膜，用無菌鑷子分別放置于培養基平板上4個區域內。每兩個膜之間的中心距離不小于35 mm，輕壓標本使其與瓊脂平板充分接觸，觀察細菌的生長情況。

1.3觀察指標測量緩釋膜體質量，通過算式計算緩釋膜降解率。降解率=（降解前質量- 降解后質量）÷ 降解前質量× 100%。用游標尺量取抑菌環直徑，通過測量抑菌環的直徑對樣品進行療效評估。計算抑菌穩定性，抑菌穩定性=｜當日抑菌圈直徑- 隔日抑菌圈直徑｜。

1.4統計方法采用SPSS 20.0 統計軟件處理數據。采用正相關檢驗分析黃芩苷含量與降解率的關系；計量資料以均數± 標準差（±s）表示，采用t檢驗分析4 種不同含量黃芩苷緩釋膜的抑菌效果。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1緩釋膜體外降解率表1 結果顯示：含黃芩苷0.5、1.0、1.5、2.0 g 的緩釋膜的8 d 降解率均＞91%， 10 d 降解率均＞96%， 12 d 降解率均為100%，表明含不同質量黃芩苷的緩釋膜體外降解率接近，均可在12 d 內完全降解。根據正相關檢驗，黃芩苷含量與緩釋膜降解率的｜r｜=0.215 ＜0.3，提示變量之間相關程度較弱。表明黃芩苷含量與緩釋膜降解率無明顯相關性。

表1 不同含量黃芩苷緩釋膜體外降解率比較Table 1 Comparison of the degradation rates of the sustained-release membranes containing different contents of baicalin （p/%）

2.2抑菌效果評價

2.2.1 抑菌圈直徑 本研究通過測量抑菌圈直徑大小進行評價，在放置緩釋膜后第1、3、5、7 天測量，具體數據見表2。結果顯示：緩釋膜抑菌時間1 d（短效）～7 d（長效）的抑菌圈直徑，均是含黃芩苷0.5 g 的緩釋膜最小，含黃芩苷2.0 g 的緩釋膜最大，各組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。表明含黃芩苷2.0 g 的緩釋膜抑菌作用最強，含黃芩苷1.5 g 的次之，且抑菌作用與黃芩苷含量呈正相關。

2.2.2 抑菌穩定性 抑菌穩定性絕對值越小，穩定性越好。圖1 結果顯示：含黃芩苷2.0 g 的緩釋膜7 d內抑菌穩定性絕對值最小，含黃芩苷1.5 g的次之，各組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。表明含黃芩苷2.0 g 的緩釋膜穩定性最好，含黃芩苷1.5 g 的次之，抑菌圈直徑隨時間的穩定性與黃芩苷含量呈正相關。

表2 不同含量黃芩苷緩釋膜抑菌圈直徑比較Table 2 Comparison of the antibacterial ring diameter of the sustained-release membranes containing different contents of baicalin （ ± s，d/mm）

表2 不同含量黃芩苷緩釋膜抑菌圈直徑比較Table 2 Comparison of the antibacterial ring diameter of the sustained-release membranes containing different contents of baicalin （ ± s，d/mm）

注：各組間比較，P ＜0.01

黃芩苷含量（m/g）0.5 1.0 1.5 2.0緩釋膜抑菌時間（t/d）1 16.10 ± 4.72 18.32 ± 4.31 22.11 ± 3.21 25.03 ± 2.97 3 17.23 ± 4.14 19.08 ± 4.15 22.62 ± 2.82 25.30 ± 2.58 5 18.67 ± 3.91 20.29 ± 3.59 23.35 ± 2.97 26.01 ± 2.13 7 17.53 ± 5.06 19.27 ± 4.56 23.06 ± 3.68 26.02 ± 3.57

圖1 不同含量黃芩苷緩釋膜抑菌穩定性比較（ ± s，d/mm）Figure 1 Comparison of the antibacterial stabilities of the sustained-release membranes containing different contents of baicalin（ ± s，d/mm）

綜上得出，含黃芩苷2.0 g 的緩釋膜抑菌效果最佳且最穩定，含1.5 g的次之。

3 討論

在深牙周袋內齦溝液中的致病菌，貫穿著整個牙周病病情發展，而且非常頑固[6]，對于重度牙周炎患者的治療，控制齦溝液內致病菌是最為棘手的關鍵問題。在臨床上，經過基礎齦上潔治、深層齦下刮治及根面平整治療后，被重度炎癥破壞的組織恢復需要一定的時間，但一部分患者在這期間牙周袋內容易再次發生感染，影響預后，造成患者生理上與心理上的困擾。目前，對于這一部分易感人群，提出在維護期期間牙周袋內放置緩釋藥物，達到有效且穩定地抑制牙周炎致病菌的功效，創造更有利于牙周組織恢復的微環境。

在早期研究中，黃芩苷含漱液在牙周病中的抑菌作用與抗炎作用已得到了證實[7-8]。含漱液對牙齦炎及輕中度牙周病療效顯著，但對于重度牙周病，牙周袋深、狹窄等問題，未必能發揮很好的效果。而緩釋膜的優勢在于可根據牙周袋形狀修剪，放置袋內至袋底后可持續、有效、充分地釋放藥力。牙周炎的主要致病微生物包括牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌、牙密螺旋體、伴放線放線桿菌[9]等。本研究提取重度牙周炎患者的自體齦溝液進行體外研究，與傳統單一牙周致病菌的體外抑菌實驗相比，更能模擬患者牙周袋內的菌群。臨床上含黃芩苷1.5 g 與2.0 g 的緩釋膜更適合應用于重度牙周炎的輔助治療，而濃度過高的緩釋膜可能會破壞牙周組織的微環境，因此，本試驗采用0.5、1.0、1.5、2.0 g等4組質量的黃芩苷粉劑進行研究[10]。本研究結果顯示，此種緩釋膜的降解速度與黃芩苷的含量無顯著相關性，此方法制備的緩釋膜可在12 d 左右完全降解，無需擔心殘留在牙周袋內，7 d內抑菌效果穩定。

綜上所述，本研究結果再次證明了黃芩苷對牙周炎致病菌的抑菌作用，且其緩釋膜劑型更持續、穩定。黃芩苷緩釋膜在口內慢性釋放，隨唾液進入胃腸道刺激小，且對大腸桿菌、金色葡萄糖菌、幽門螺桿菌等腸道致病菌有抑制作用[11]，可長期在口內使用，對提高牙周治療效果值得再進一步探究與應用。為進一步證實其臨床應用前景，本團隊計劃下一步招募志愿者，開展小范圍的臨床應用研究，以期為重度慢性牙周炎的臨床治療提供科學依據。