五味子素B增強膠質瘤細胞U-251MG化療敏感性

劉紅艷， 張婷， 朱慧敏， 劉麗， 張曉東

（1.恩施土家族苗族自治州中心醫院腫瘤放療中心，湖北恩施 445000；2.湖北民族大學附屬民大醫院腫瘤科，湖北恩施 445000）

膠質瘤是原發性腦腫瘤中最嚴重和侵襲性最強的一種[1]。替莫唑胺（temozolomide）應用于臨床上新診斷的惡性膠質瘤和復發性惡性膠質瘤的治療。替莫唑胺的臨床應用是近10 年來惡性膠質瘤化療的最大亮點，其聯合放療已成為膠質瘤的標準治療方法[2-5]。替莫唑胺的治療機制主要是能有效地抑制膠質瘤細胞的增殖并誘導細胞凋亡[5]，然而，膠質瘤細胞通常對替莫唑胺產生抵抗并降低替莫唑胺的細胞毒性。替莫唑胺產生化學耐藥性是膠質瘤患者預后不良的主要原因。提高替莫唑胺對膠質瘤細胞的敏感性具有重要的臨床意義。本研究擬觀察五味子素B 對人膠質瘤細胞系U-251MG增殖、凋亡和自噬的影響，探討五味子素B是否增加替莫唑胺對膠質瘤細胞的化療敏感性，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞與培養人膠質瘤U-251MG 細胞來源于美國模式培養物保藏所（American Type Culture Collection， ATCC）。 U- 251MG 細胞以體積分數10%胎牛血清（FBS）和1%青-鏈霉素的DMEM培養基，在37 ℃體積分數5% CO2恒溫培養箱中培養。培養基每2 ～3 d更換1次。當需要收集細胞時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化。

1.2藥物、試劑與儀器五味子素B（美國Selleck公司），純度為99.94%，化學式為C23H28O6，分子量為400.46；替莫唑胺（美國Sigma-Aldrich 公司）。五味子素B 和替莫唑胺都溶于體積分數10% 二甲基亞砜（DMSO）中，母液（替莫唑胺：100 mg/mL），使用時稀釋。 DMEM培養基、FBS、青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；DMSO、細胞計數試劑盒8（CCK-8）（美國Simga公司）；抗Beclin 1、p62、微管相關蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3， LC3）、 Ki67、 cleaved Caspase-3、Caspase-3 抗體（美國Abcam 公司）。Varioskan LUX 多功能酶標儀（美國ThermoFisher 公司）；BX53正置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；TCS SP8 X 激光共聚焦顯微鏡（德國萊卡公司）；Tanon 4800 Multi凝膠成像儀（上海天能公司）。

1.3細胞實驗

以不同質量濃度（0、 0.05、 0.1、 0.2、 0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μmol/L）五味子素B 處理U-251MG 細胞后，應用CCK-8 法測定細胞存活率。后續實驗選擇2.5 μmol/L 的五味子素B進行處理。將U-251MG 細胞分為4 組：對照組（U-251MG）、五味子素B 組、替莫唑胺組、協同組。根據Carmo A 等[6]研究確定替莫唑胺的處理濃度為100 μmol/L。

1.3.1 CCK-8測定細胞增殖能力 連續培養各組U-251MG細胞0、24、48、72、96 h，收集各組待測細胞檢測細胞吸光度。首先，用培養基將CCK-8溶液稀釋到10%，再用上述溶液將待測細胞制成1 × 106個/mL的細胞懸液，然后，37 ℃培養1 ～4 h，最后應用酶標儀于波長490 nm處檢測吸光度值。

1.3.2 Hoechst染色測定細胞凋亡情況 將U-251MG細胞消化、離心收集，用含體積分數2%FBS 的DMEM培養基重懸，調細胞密度約為1 × 106個/mL。按照說明書操作方法，加入Hoechst 33342 染液，37 ℃孵育1 h。最后，在熒光顯微鏡下，觀察拍照。在隨機選取的6個視野中，通過計算細胞核濃縮的細胞數量來確定凋亡細胞的數量。

1.3.3 免疫熒光法檢測細胞LC3表達 U-251MG細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3 次，室溫下用40 g/L 多聚甲醛固定，再用體積分數3% BSA 孵育90 min，PBS 沖洗3 次，然后在室溫下用LC3 一抗孵育1 h，用0.1 g/mL 4’6-二脒基-苯基吲哚（DAPI）孵育3 min，用二抗孵育30 min。最后應用共聚焦熒光顯微鏡拍照，獲得熒光圖像。

1.3.4 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測細胞增殖、自噬、凋亡相關蛋白的表達 藥物處理后，收集各組待測U-251MG 細胞，用PBS 清洗3 次，加入含絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）的RAPI細胞裂解液進行總蛋白提取，以牛血清白蛋白為標準，采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白質樣品（20 mg），100 ℃變性5 min，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離并轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 ～2 h后加入相應的一抗，于4 ℃過夜孵育；次日，清洗后再加入辣根過氧化物酶標記（HRP）的二抗，室溫孵育1 h，清洗。最后加入發光液，于凝膠成像儀進行曝光拍照，并用ImageJ 軟件統計灰度值計算相對表達量。GAPDH 作為上樣量參照，至少進行3 次獨立的實驗。

1.4動物實驗

1.4.1 分組、造模與給藥 為驗證五味子素B 聯合替莫唑胺的體內療效，本研究采用6周齡雌性胸腺裸鼠皮下注射U- 251MG 細胞（2 × 105個/mL，Hank’s 平衡鹽溶液稀釋）建立異位異種移植瘤模型。動物分為4組，即對照組、五味子素B組、替莫唑胺組、協同組，每組小鼠8 只。U-251MG細胞注射后第1天，五味子素B組給予五味子素B 5.0 mg·kg-1·d-1灌胃，替莫唑胺組給予替莫唑胺2.0 mg·kg-1·d-1灌胃。給藥30 d 后所有小鼠給予頸椎脫臼法處死。

1.4.2 腫瘤體積觀察 用游標卡尺測量腫瘤直徑，計算腫瘤體積，公式：橢球體的體積= 長×（寬）2× 0.5。

1.4.3 免疫組織化學法檢測腫瘤組織Ki67、Caspase-3表達 石蠟包埋的腫瘤切片（2 μm）經脫蠟后，用檸檬酸緩沖液進行熱誘導抗原修復。內源性過氧化物酶在室溫下用體積分數20%過氧化氫 阻 斷15 min， 然后分別用抗Ki67 抗體、 抗Caspase-3 抗體孵育30 min。將生物素化山羊抗小鼠免疫球蛋白G二抗孵育30 min，在Tris-HCl緩沖液（TBS）中洗滌后，用過氧化物酶標記的鏈霉親和素試劑和3，3’-二氨基聯苯胺（DAB）孵育復染5 min。脫水干燥后顯微鏡下觀察。

1.5統計方法采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，實驗數據均以均數± 標準差（±s）表示，兩兩比較用獨立的t檢驗，分析比較處理組與對照組之間增殖倍數、凋亡率以及蛋白表達的差異。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1五味子素B降低膠質瘤細胞U-251MG存活率選擇如圖1 所示梯度濃度的五味子素B 處理U-251MG 細胞48 h 后，采用CCK-8 法測定細胞存活情況。五味子素B 在1 μmol/L 及以下的濃度時，細胞存活率無顯著性差異（P＞0.05）；五味子素B 2.5 μmol/L 及以上濃度時，細胞存活率下降（P＜0.05或P＜0.01，與對照組比較），表現出細胞毒性。故選擇對U-251MG 細胞低毒性的劑量2.5 μmol/L作為五味子素B 單獨或聯合處理濃度進行后續實驗。

圖1 不同質量濃度五味子素B降低膠質瘤細胞U-251MG存活率Figure 1 Different mass concentrations of Schisandrin B deceases survival rate of U-251MG cells

圖2 五味子素B增強替莫唑胺誘導的U-251MG增殖抑制和凋亡Figure 2 Schisandrin B enhances temozolomide-induced proliferation inhibition and apoptosis in U-251MG cells

2.2五味子素B增強替莫唑胺誘導的U-251MG增殖抑制和凋亡如圖2-A 所示，與對照組比較，五味子素B 組、替莫唑胺組和協同組促進U-251MG細胞凋亡（P＜0.01），且協同組的促進作用優于替莫唑胺組（P＜0.01）。如圖2-B所示，與對照組比較，五味子素B組、替莫唑胺組和協同組均抑制U-251MG細胞的生長（P＜0.01），且協同組的抑制作用優于替莫唑胺組（P＜0.05）。通過對U-251MG細胞凋亡關鍵蛋白Ki67和cleaved Caspase-3的Western Blot 分析，驗證了上述結果，如圖2-C、-D所示，與對照組比較，五味子素B組、替莫唑胺組和協同組U-251MG細胞Ki67的相對表達水平顯著降低（P＜0.05），而cleaved Caspase-3 的相對表達水平升高（P＜0.05），且協同組的作用效果優于替莫唑胺組（P＜0.05）。

2.3五味子素B增強替莫唑胺誘導的U-251MG細胞自噬采用免疫熒光法檢測LC3 表達情況如圖3-A 所示，與對照組比較，五味子素B 組、替莫唑胺組和協同組U-251MG 細胞LC3 表達水平明顯升高，且協同組升高作用優于替莫唑胺組（P＜0.01）。 Western Blot檢測結果如圖3-B所示，與對照組比較，五味子素B組、替莫唑胺組和協同組均顯著下調細胞自噬關鍵蛋白p62 蛋白水平，上調Beclin 1 蛋白表達水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（P＜0.01），且協同組上調Beclin 1 蛋白表達、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的作用和下調p62 蛋白表達的作用優于替莫唑胺組（P＜0.01）。

圖3 五味子素B增強替莫唑胺誘導的U-251MG細胞自噬Figure 3 Schisandrin B enhances temozolomide -induced autophagy in U-251MG cells

2.4五味子素B增強替莫唑胺誘導的腫瘤生長抑制如圖4-A 所示，從左至右分別為對照組、五味子素B組、替莫唑胺組和協同組小鼠體內取出的腫瘤。與對照組比較，五味子素B組、替莫唑胺組和協同組腫瘤體積明顯減小（P＜0.01）；與替莫唑胺比較，協同組腫瘤體積更小（P＜0.01）。具體結果見圖4-B。免疫組織化學法分析腫瘤組織Ki67和Caspase-3的表達，如圖5-A、-B所示，與對照組比較，五味子素B 組、替莫唑胺組和協同組Ki67 的表達水平均明顯降低，Caspase-3 的表達水平升高，且協同組對Ki67的降低作用與對Caspase-3的升高作用明顯優于替莫唑胺組（P＜0.01）。

圖4 五味子素B協同替莫唑胺抑制膠質瘤生長Figure 4 Schisandrin B enhances the effect of temozolomide on inhibit glioma growth

圖5 五味子素B協同替莫唑胺抑制膠質瘤Ki67表達、促進Caspase-3表達Figure 5 Schisandrin B enhances the effect of temozolomide on inhibiting Ki67 expression and promoting Caspase-3 expression in glioma

3 討論

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的果實，味酸，性溫，有斂肺滋腎、生津止汗、澀精止瀉、安神的功效，可治久嗽虛喘、消渴、津少口干、自汗、盜汗、遺精、久瀉、瞳孔散大、健忘、失眠等病癥。五味子素B（schisandrin B）是從五味子中提取出來的有效成分。藥理學研究表明，五味子素B不僅用于治療神經退行性疾病[7]、胃癌[8]、乳腺癌[9]，還可抑制膠質瘤[10-12]。然而，既往研究未見有關五味子素B 是否增加替莫唑胺對膠質瘤細胞的化療敏感性的報道。本研究體外實驗結果顯示，五味子素B 抑制U-251MG 細胞的活力（P＜0.05 或P＜0.01）。與對照組比較，五味子素B組、替莫唑胺組和協同組均增加U-251MG 凋亡細胞比率，升高細胞cleaved Caspase-3 表達水平，增加細胞核內LC3 陽性色斑，減弱p62表達，增強Beclin 1表達及升高LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（均P＜0.01）。體內實驗結果顯示，與對照組比較，五味子素B組、替莫唑胺組和協同組均減小異種移植膠質瘤體積，降低Ki67 表達，增強Caspase-3 表達（均P＜0.01）。且協同組的上述作用效果均優于替莫唑胺組（均P＜0.01）。表明五味子素B可抑制膠質瘤細胞增殖，促進膠質瘤細胞凋亡，誘導膠質瘤細胞自噬。與上述研究[8-12]一致，證實了五味子素B的抗膠質瘤作用，同時表明五味子素B對替莫唑胺化療的治療效果有協同增效作用。

膠質瘤是一種具有高度增殖和侵襲能力的惡性腫瘤[13]。同時，膠質瘤是對傳統化療最具抵抗力的腫瘤之一，即使經過傳統的手術切除結合化療或放療，患者的生存率仍然較低[14-15]。為了克服這一障礙，目前的研究主要集中于化療藥物與其他藥物的結合應用以及新型分子靶向藥物的開發[16-18]。近年來，膠質瘤替莫唑胺治療的改進被廣泛報道，microRNAs、中藥提取物被證明可增強替莫唑胺對膠質瘤的敏感性[19-22]。本研究結果表明，五味子素B 可協同替莫唑胺殺傷膠質瘤U-251MG細胞和小鼠異種移植瘤。單獨五味子素B處理，其增殖抑制作用、凋亡和自噬促進作用不如單獨替莫唑胺處理強，說明單獨五味子素B治療膠質瘤療效不如替莫唑胺，替莫唑胺仍是膠質瘤化療的相對更有效的藥物。然而，將五味子素B和替莫唑胺聯合使用，表現出比單獨替莫唑胺使用更強的抗膠質瘤潛力，說明五味子素B可增強替莫唑胺對膠質瘤細胞和腫瘤的敏感性，降低膠質瘤對替莫唑胺的抵抗性。

綜上所述，五味子素B可以誘導膠質瘤細胞凋亡和自噬，具有抗膠質瘤細胞增殖和腫瘤生長的作用。同時，五味子素B可增強替莫唑胺對膠質瘤的敏感性，增強替莫唑胺對膠質瘤細胞增殖的抑制作用、對細胞凋亡和自噬的促進作用，且五味子素B增強了替莫唑胺對膠質瘤實體瘤生長的抑制作用。