基于網絡藥理學預測金錢草治療泌尿系結石的作用機制

黃麗， 孫曉靜， 孫治中， 陳慧玲， 謝建興， 崔學教

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405）

泌尿系結石是常見的泌尿系統疾病，據統計，全世界泌尿系結石的發病率已達11%～15%[1]，且有逐年升高的趨勢。雖然體外沖擊波碎石、經皮腎鏡碎石取石、輸尿管鏡碎石取石等微創手術已經廣泛采用并取得較好的治療效果，但泌尿系結石的復發率仍比較高[2]。中醫藥治療泌尿系結石有良好的療效。崔學教教授認為，治當 “唯重利尿”，同時也特別注意固護正氣。通淋排石藥多為寒涼之品，久服必傷陽氣，故崔老臨證運用利尿之法，多首選藥性較平的金錢草。金錢草是治療泌尿系結石的常用中藥，具有抗結石生成、利尿、抗炎和減輕輸尿管張力的作用。但目前針對金錢草的研究局限于單一成分、單靶點，其具體機制尚不明確。網絡藥理學是在生物信息學、多向藥理學[3]、系統生物學[4]的基礎上，通過多成分-多靶點-多通路更加系統地探討中藥及方劑對相關疾病作用機制的研究方法[5]。故本研究基于網絡藥理學預測金錢草治療泌尿系結石的靶點、通路富集分析以探討其作用機制，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1活性成分的獲取以 “金錢草” 為檢索詞，通過中藥系統藥理學技術平臺（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索其化學成分，將口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 作為活性成分篩選條件，篩查出符合條件的活性成分，點擊其成分的詳細信息，保存活性成分的2D結構。

1.2預測金錢草相關靶點在Pubchem 中檢索篩選出的活性成分，找出它們對應的smile 號，保存為SDF 文件，上傳至SwissTargetPrediction 數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）， 基 于 反 向分子對接原理，依據成分的2D/3D結構進行靶點預測，得到金錢草的預測靶點。

1.3泌尿系結石相關靶點的獲取及與金錢草預測靶點的映射以 “Urinary Calculus” 為檢索詞，通過GeneCards數據庫獲取泌尿系結石相關靶點。將金錢草的預測靶點與泌尿系結石相關靶點進行映射得到金錢草治療泌尿系結石的預測靶點。

1.4蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建通過String 數據庫設定物種為 “Homo snpiens” 獲取全部蛋白-蛋白相關作用關系，導入Cytoscape 3.6.0軟件，生成背景網絡。在背景數據庫選中上述映射得到的金錢草作用于泌尿系結石的靶點，并找到與其直接相連的節點，作為金錢草治療泌尿系結石的PPI網絡。

1.5 Hub網絡的提取通過Cytoscape 3.6.0 軟件Tools 模塊中NetworkAnalyzer- Network Analysis-Analyze Network 進行網絡分析獲取相關拓撲參數，選取節點連接度（Degree）的二倍中位數、節點介度（Betweenness）和節點緊密度（Closeness）的中位數作為篩選依據，提取出Hub網絡。

1.6基因本體論（GO）富集分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析應用Cytoscape 3.6.0 軟件中的ClueGO 插件，選擇BiologicalProcess（生物進程），對Hub網絡中的靶標進行GO富集分析。通過DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）網站對上述分析結果進行KEGG通路分析并進行篩選，得到顯著富集（P＜0.01）的通路，并按照基因（Gene）數從大到小排序，結合文獻檢索，篩選出治療泌尿系結石的可能通路，找到其通路上的相關靶標。結合金錢草的活性成分，構建出金錢草活性成分-泌尿系結石靶標-KEGG通路的網絡圖。將篩選出來的20 條相關通路，繪制成KEGG 通路富集分析柱狀圖。

1.7分子對接驗證成分與靶點的結合能力運用systems Dock 網 站（http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）對Degree值排名前5位的預測靶標與金錢草活性成分進行分子對接，通過比較與原生配體的結合分值大小來評價結合的穩定性。

2 結果

2.1金錢草活性成分本研究將OB ≥30%、DL ≥0.18 作為活性成分篩選條件，篩選出活性化合物10 種，化合物名稱、相關參數及化學結構式見表1。

表1 金錢草活性成分Table 1 Data of active ingredients from Herba Lysimachiae

2.2金錢草預測靶點以及活性成分-泌尿系結石靶點網絡構建在SwissTargetPrediction 數據庫中篩選出10 種活性化合物對應的135 個靶點，依據成分的2D/3D 結構進行靶點預測，篩選出98 個靶點作為金錢草的預測靶點。將所得的金錢草預測靶點與GeneCards 數據庫獲取的1 043 個泌尿系結石相關靶點相映射，篩選出金錢草可能與泌尿系結石相關的靶點21個。在Cytoscape 3.6.0軟件中導入金錢草的活性成分與泌尿系結石相關的靶點，構建金錢草活性成分-泌尿系結石靶點網絡圖（見圖1）。如圖1 可見，此網絡中共包括76 個節點，其中，包括9個化合物，21個靶點，91個邊。

圖1 金錢草活性成分-泌尿系結石靶點網絡圖Figure 1 Network of Herba Lysimachiae active ingredients- urinary calculus targets

2.3 PPI網絡的構建將21 個金錢草可能與泌尿系結石相關的靶點導入String 數據庫得到蛋白-蛋白相關作用關系，通過Cytoscape 3.6.0 軟件，形成金錢草治療泌尿系結石的PPI網絡（見圖2）。如圖2顯示，此網絡中共包括192 個節點，965 個邊。圖中節點大小是按Degree 值的大小形成，Degree 值越大，節點越大。

圖2 金錢草治療泌尿系結石的PPI網絡Figure 2 PPI network of Herba Lysimachiae treatment for urinary calculus

2.4 Hub網絡的提取及Hub中的靶標選取Degree的二倍中位數、Betweenness 和Closeness 的中位數作為篩選依據，通過Cytoscape 3.6.0 軟件得到Hub中的靶標，即金錢草治療泌尿系結石的關鍵靶點，提取出Hub 網絡（見圖3）。關鍵靶點共8 個，按照Degree 值從大到小排序分別為表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體1（ESR1）、醛糖還原酶（AR）、表皮生長因子受體2（ERBB2）、雌激素受體2（ESR2）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、肝X受體β（NR1H2）、血清鈣（CA2）。

圖3 金錢草治療泌尿系結石的Hub網絡Figure 3 Hub network of Herba Lysimachiae treatment for urinary calculus

2.5 GO富集分析應用Cytoscape 3.6.0 軟件中ClueGO插件，進行GO富集中的生物進程分析，得到11 個功能組別（見圖4）以及其占比餅狀圖（見圖5）。

圖4 金錢草治療泌尿系結石GO富集分析功能組別圖Figure 4 Diagram for GO enrichment analysis of functional groups Herba Lysimachiae treatment for urinary calculus

圖5 金錢草治療泌尿系結石的GO富集分析功能組別占比餅狀圖Figure 5 Pie chart for GO enrichment analysis of functional group proportion in Herba Lysimachiae treatment for urinary calculus

2.6 KEGG通路分析通過KEGG 通路分析得到126條通路，結合文獻檢索，篩選出金錢草治療泌尿系結石的可能通路為8條，繪制KEGG通路的網絡圖（見圖6）。主要分為2 類：①泌尿系炎癥及黏膜相關通路：磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信號通路、血趨化因子信號通路、核因子E2相關因子2/ Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Nrf2/Keap1）信號通路、p38 絲裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）信號通路、酪氨酸激酶/信號轉導和轉錄激活子（JAK/STAT）信號通路等；②尿鈣相關通路：核因子κB（NF-κB）信號通路、辣椒素受體5（TRPV5）信號通路。

圖6 金錢草治療泌尿系結石的KEGG通路富集分析柱狀圖Figure 6 Histogram for KEGG pathway enrichment analysis of Herba Lysimachiae treatment for urinary calculus

2.7構建金錢草活性成分-泌尿系結石靶標-KEGG通路的網絡圖將上述8條相關通路，找到其通路上的相關靶標，結合金錢草的活性成分，構建出金錢草活性成分-泌尿系結石靶標-KEGG通路的網絡圖（見圖7）。

2.8分子對接運用systems Dock 網站對Degree值排名前5位的預測靶標與金錢草活性成分進行分子對接，根據Docking Score值的大小應用GraphPiad Prism 7.0 軟件制作出熱圖（見圖8）。Docking Score值在4.25 以上認為分子與靶點有一定的結合活性，大于5.0 說明有較好的結合活性，大于7.0 說明具有強烈的結合活性。熱圖結果顯示，大部分Docking Score值高于4.25，提示金錢草活性成分與預測靶標有一定的結合能力。

圖7 金錢草活性成分-泌尿系結石靶標-KEGG通路的網絡圖Figure 7 Multiple compound-target-pathway network of Herba Lysimachiae

圖8 金錢草治療泌尿系結石預測靶標及活性成分分子對接熱圖Figure 8 Molecular docking heat map for predicted targets and active components

3 討論

目前，針對金錢草治療泌尿系結石的研究局限于單一成分、單靶點，其具體機制尚不明確，本研究運用網絡藥理學從分子水平對其作用機制進行探討分析。

3.1金錢草治療泌尿系結石的關鍵靶點預測結果表明，金錢草治療泌尿系結石的關鍵靶點有8 個，具體為EGFR、ESR1、AR、ERBB2、ESR2、MMP-2、NR1H2、CA2。有研究表明：EGFR 能延緩腎小管細胞的壞死程度，在腎損壞中起保護性作用[6]；ESR1 能抑制草酸引起的腎小管上皮細胞氧化應激損傷及抑制結石相關炎癥介質的表達[7]；AR活性升高，會導致腎臟細胞內信號轉導通路發生改變，進一步加重腎臟功能損害[8-9]；ERBB2 在腎臟纖維化中發揮著重要的作用[10]；在結石導致的急性腎功能損傷中，MMP-2 及炎癥介質表達上調，血液水平上升，參與炎癥反應及腎小球、腎小管基底膜的降解[11]；CA2升高，尿鈣沉積，是腎結石形成的重要原因之一，長期高鈣血癥可能造成腎小管功能失衡[12]。

3.2金錢草治療泌尿系結石的炎癥及黏膜相關通路金錢草治療泌尿系結石的炎癥及黏膜相關通路有PI3K-Akt 信號通路、血趨化因子信號通路、Nrf2/Keap1 信號通路、P38MAPK 信號通路、JAK/STAT 信號通路等。PI3K /Akt 信號通路在調節細胞存活、增殖和凋亡中起重要作用[13]。多種酶、細胞因子、蛋白等通過調節PI3K /Akt 信號通路在抑制炎性反應及血管增生中發揮抗腎小球足細胞衰亡的作用，從而達到修復急性腎功能損傷的功效[14]。血趨化因子不僅可以介導趨化、誘導細胞粘附、促進細胞生長，還具有參與全身炎癥免疫反應等生物學功能[15]，故其可能具有調節泌尿系結石引發的腎盂腎炎的作用。Kong等[16]研究發現，Nrf2基因缺失不僅可以加重單純輸尿管梗阻引起的腎損害，還可以在后期加重腎纖維化的進程，同時，Nrf2除了抑制氧化應激反應，進而下調腎臟炎癥反應以外，還可直接抑制NF-κB 介導的炎癥反應[17-18]。P38MAPK信號通路影響草酸、草酸鈣晶體誘導的大鼠腎臟氧化應激和炎癥損傷反應、腎臟局部RAS 系統改變、腎臟緊密連接的改變，從而起到抑制草酸鈣結石生成和保護腎功能的作用[19]。JAK/STAT 信號通路是介導炎癥反應的重要信號通路之一，在多種泌尿系疾病包括泌尿系結石中具有調控作用[20]。

3.3金錢草治療泌尿系結石的尿鈣相關通路金錢草治療泌尿系結石的尿鈣相關通路包括NF-κB信號通路、TRPV5 信號通路。盧宇超[21]研究表明，通過激活NF-κB 信號通路，引起其下游黏附分子增加，從而介導草酸鈣晶體在腎小管上皮細胞胞膜表面的粘附及增長。TRPV5 信號通路在調控尿鈣水平中發揮重要的作用[22]，TRPV5的表達與尿鈣與泌尿系結石的發生率成負相關[23]，其表達下降或缺乏可使腎小管對鈣的重吸收減少，進而產生高鈣尿，尿鈣飽和析出，形成泌尿系結石。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學篩選金錢草的主要成分，并對靶標、通路進行功能分析，最后采用分子對接技術驗證金錢草與泌尿系結石關鍵靶點的結合，預測了金錢草治療泌尿系結石的分子作用機制。結果顯示：金錢草通過多靶點、多通路治療泌尿系結石，可能在炎癥及黏膜相關通路、尿鈣相關通路上起作用。基于此，今后在臨床中可進一步研究金錢草在泌尿系感染、結石成分破壞與分解方面的作用機制，并進行金錢草制劑的開發工作。另外，在現代中藥復方中普遍存在 “多向藥理學” 效應和 “疊加” 效應，也可對中藥復方的組成、質量控制和作用機制進行進一步深入研究。