薯蕷皂苷抑制HMGB1/TLR4/NF-κB p65通路的活化對(duì)老年大鼠急性腦出血模型血灶周圍細(xì)胞凋亡和炎性因子的影響

田青， 黃齊飛， 黃天韜， 周倩， 翟中良

（1.鄂東醫(yī)療集團(tuán)市中心醫(yī)院，湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院老年病科，湖北黃石 435000；2.鄂東醫(yī)療集團(tuán)市中心醫(yī)院，湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北黃石 435000）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂引起的出血，以中老年人多發(fā)，每年全球新發(fā)200萬腦卒中的患者，腦出血占到10% ～15%[1]。急性腦出血（acute cerebral hemorrhage，ACH）是指腦出血的急性期，是腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血的危急重癥，起病急，進(jìn)展迅速。目前，腦出血的機(jī)制尚不完全清楚，且缺乏有效的治療手段[2]。但腦水腫、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等過程在腦出血的病理生理中具有重要作用，如何有效地降低腦出血后的腦水腫和抑制腦出血后的炎性反應(yīng)，是研究的熱點(diǎn)[3-4]。薯蕷皂苷（dioscin）廣泛存在于薯蕷科、百合科等藥用植物中，具有抗腫瘤[5]、抗炎[6]、抗骨質(zhì)疏松[7]等生物學(xué)活性。已有研究表明，薯蕷皂苷可通過降低膠質(zhì)細(xì)胞活化及維持超氧化物歧化酶（SOD）水平減輕腦卒中小鼠的神經(jīng)損傷[8]，薯蕷皂苷元對(duì)大鼠腦短暫性局灶性腦缺血再灌注損傷具有明顯的抑制作用[9]，但薯蕷皂苷作用于腦出血的研究鮮有報(bào)道。因此，本研究探討薯蕷皂苷對(duì)老年大鼠急性腦出血模型血灶周圍細(xì)胞凋亡及炎性因子的影響，并分析其作用機(jī)制，以期為薯蕷皂苷的臨床應(yīng)用開發(fā)提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物SPF級(jí)24 ～26個(gè)月齡雄性SD大鼠50只，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018。飼養(yǎng)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心動(dòng)物飼養(yǎng)室，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水，光周期12/12 h，相對(duì)濕度為55%，溫度為22 ℃。

1.2藥物、試劑與儀器薯蕷皂苷（純度≥98%，廣州左克生物科技公司，批號(hào)：ZK-17102215）；水合氯醛、骨蠟（廣州齊云科技公司）；cleaved Caspase- 3、 Caspase- 3、 cleaved Caspase- 9、Caspase- 9、 Bax、 Bcl- 2、 高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、Toll 樣受體4（TLR4）、核因子kappa B（NF- κB）p65、 磷 酸 化NF- κB p65（p- NF- κB p65）、GAPDH 等一抗，二抗（英國(guó)Abcam 公司）；原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）標(biāo)記（TUNEL）檢測(cè)試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物科技公司）；白細(xì)胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-1β、IL-10 酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海康朗生物科技公司）。立體定位儀（美國(guó)Bio-sciences 公司）；手持牙科鉆（上海精密科學(xué)儀器公司）；光學(xué)、熒光顯微鏡（日本奧林巴期公司）；多功能酶標(biāo)儀（瑞士TECAN 公司）。

1.3分組、造模與給藥將SD 雄性老年大鼠隨機(jī)分為5 組，即正常對(duì)照組， 模型對(duì)照組，薯蕷皂苷低、中、高劑量組，每組各10 只。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠構(gòu)建急性腦出血模型，方法[10]：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，使用微量注射器抽自體尾動(dòng)脈血50 μL 備用（作為注入所用的血液）。35 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，后將大鼠置于立體定位儀。大鼠頭部行正中切口，以前囟為0 點(diǎn)，前囟后4 mm，中線左側(cè)3 mm處用手持式牙科鉆，鉆直徑為1 mm的孔，通過鉆孔以20 μL/min速度將血液緩緩?fù)七M(jìn)腦組織，留針30 min 后拔出，用骨蠟封閉后縫合。正常對(duì)照組不注入血液。在大鼠腦組織注射自體鼠尾動(dòng)脈血液后，可見大鼠迅速出現(xiàn)行為和神經(jīng)功能異常，表現(xiàn)出反應(yīng)遲鈍、皮毛無光澤、精神萎縮、進(jìn)食下降，對(duì)側(cè)肢體出現(xiàn)癱瘓，行走追尾，嚴(yán)重者不能站立/打滾，個(gè)別大鼠呈現(xiàn)意識(shí)障礙、昏迷等表現(xiàn)，其功能異常程度與出血的嚴(yán)重程度相關(guān)。腦組織標(biāo)本可見明顯的血腫占位。結(jié)合大鼠造模3 d后的行為學(xué)評(píng)分，計(jì)2 ～3 分者提示模型建立成功[11]。造模成功后，薯蕷皂苷低、中、高劑量組分別對(duì)應(yīng)灌胃薯蕷皂苷20、40、80 mg·kg-1·d-1[12]，共給藥14 d。給藥期間，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃等量溶媒（體積分?jǐn)?shù)5%乙醇+ 蒸餾水）。給藥結(jié)束后，用100 g/L 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取血，斷頭取腦，分離腦組織血腫部位，冷凍備用。

1.4觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 腦組織含水量與腦指數(shù)計(jì)算及神經(jīng)功能評(píng)分 各組大鼠處死后，迅速取出大腦，快速稱取大腦濕質(zhì)量，然后將大腦放在95 ℃的烘箱中烘烤24 h，快速稱取大腦干質(zhì)量，計(jì)算腦組織含水量與腦指數(shù)。腦組織含水量=（大腦濕質(zhì)量- 大腦干質(zhì)量）/大腦濕質(zhì)量× 100%。腦指數(shù)= 濕腦質(zhì)量/體質(zhì)量× 100%。神經(jīng)功能評(píng)分采用單盲法（評(píng)分者不知道實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組情況）。采用Longa[13]的5 分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分為無癥狀；1 分為不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2 分為向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3 分為向?qū)?cè)傾倒；4 分為不能自行行走，意識(shí)喪失。1 ～3 分提示造模成功，0、4分提示造模不成功。

1.4.2 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腦組織病理形態(tài) 將大鼠的腦組織樣本用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定、脫水、包埋，用石蠟切片機(jī)對(duì)包埋后的腦組織標(biāo)本進(jìn)行切片，然后對(duì)切片進(jìn)行脫蠟和HE染色，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察腦組織病理形態(tài)。

1.4.3 TUNEL染色法觀察腦組織細(xì)胞凋亡情況 取腦內(nèi)血腫部位， 制成常規(guī)的石蠟切片， 按照TUNEL 檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作。方法：切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。體積分?jǐn)?shù)0.3%H2O2封閉30 min。20 μg/mL 蛋白酶k 消化25 min。TdT 酶反應(yīng)液，37 ℃孵育60 min。加入抗熒光素抗體，37 ℃孵育30 min，潮濕保溫。磷酸鹽緩沖液（PBS）振洗3 次。DAB 顯色10 min，蘇木精復(fù)染，脫水，封片。應(yīng)用倒置顯微鏡，400倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算凋亡陽性細(xì)胞數(shù)百分比。

1.4.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)Caspase-3、cleaved caspase-3、Caspase-9、cleaved caspase-9、Bax、 Bcl- 2、 HMGB1、 TLR4、 NF- κB p65、p-NF-κB p65表達(dá) 取腦內(nèi)血腫組織，剪碎后，加入細(xì)胞裂解液RIPA，以12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清。應(yīng)用BCA 試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度。以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白后，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。用50.0 g/L 脫脂牛奶室溫封閉蛋白1 h， 加入一抗（分別為cleaved Caspase- 3、Caspase- 3、 cleaved Caspase- 9、Caspase-9、Bax、Bcl-2、HMGB1、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、GAPDH等抗體，稀釋濃度為1∶1 000），于4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶HRP 標(biāo)記的二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h。電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯示條帶、所得條帶用ImageJ軟件進(jìn)行半定量分析。

1.4.5 ELISA 法檢測(cè)血清IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10的含量 收集各組大鼠血清，按照試劑盒說明書操作。方法：樣品加入反應(yīng)孔，孵育45 min。洗滌液洗滌3 次。加入生物素標(biāo)記的抗體，反應(yīng)30 min。再次洗滌后，加入鏈霉親和素-HRP 抗體，反應(yīng)30 min。加入顯色劑避光顯色15 min。最后加入終止液，應(yīng)用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm 處測(cè)吸光度值。

1.4.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦組織ICAM-1 表達(dá) 按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。方法：腦組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。使用枸櫞酸鈉緩沖液進(jìn)行熱抗原修復(fù)。加入一抗ICAM-1（1∶200），4 ℃過夜，PBS 洗滌3 次。加入生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育1 h。DAB 顯色液反應(yīng)染色。蘇木素染核，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于倒置顯微鏡40倍視野下觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Image-ProPlus 6.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算平均光密度值。

1.5統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，多組比較采用單因素方差分析，組間差異比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠腦含水量、神經(jīng)功能評(píng)分及腦指數(shù)比較表1結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的腦含水量明顯增多，神經(jīng)功能評(píng)分及腦指數(shù)增高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，薯蕷皂苷中、高劑量組的腦含水量明顯減少，神經(jīng)功能評(píng)分及腦指數(shù)明顯降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠腦含水量、神經(jīng)功能評(píng)分及腦指數(shù)比較Table 1 Comparison of the brain water content，nerve function score and brain index of rats in various groups （ ± s）

表1 各組大鼠腦含水量、神經(jīng)功能評(píng)分及腦指數(shù)比較Table 1 Comparison of the brain water content，nerve function score and brain index of rats in various groups （ ± s）

①P ＜0.05，與正常對(duì)照組比較；②P ＜0.05，與模型對(duì)照組比較

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組薯蕷皂苷低劑量組薯蕷皂苷中劑量組薯蕷皂苷高劑量組N/只10 10 10 10 10腦含水量（p/%）73.21 ± 9.96 89.16 ± 12.32①88.69 ± 10.63 80.31 ± 7.97②75.99 ± 12.83②神經(jīng)功能評(píng)分（s/分）0.05 ± 0.01 2.82 ± 0.26①2.69 ± 0.33 1.67 ± 0.41②1.03 ± 0.28②腦指數(shù)0.36 ± 0.06 0.72 ± 0.08①0.71 ± 0.07 0.48 ± 0.05②0.32 ± 0.06②

2.2各組大鼠腦組織病理變化比較圖1 結(jié)果顯示：正常對(duì)照組大鼠的腦組織結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，細(xì)胞著色均勻；模型對(duì)照組的腦組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)異常，神經(jīng)細(xì)胞之間的間隙增大并且排列紊亂，部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)凝集、核固縮的現(xiàn)象；薯蕷皂苷低、中劑量組形態(tài)結(jié)構(gòu)異常程度較模型對(duì)照組輕，但仍有部分細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)凝集、核固縮現(xiàn)象，薯蕷皂苷高劑量組的腦組織結(jié)構(gòu)與神經(jīng)細(xì)胞明顯恢復(fù)正常。

2.3各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況比較圖2 結(jié)果顯示：正常對(duì)照組中正常細(xì)胞沒有被染色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組細(xì)胞核呈棕黃色，細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，薯蕷皂苷中、高劑量組細(xì)胞凋亡率明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠腦組織病理變化比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the morphological features of brain tissue of rats in various groups（by HE staining，×200）

2.4各組大鼠腦組織中Caspase-3、Caspase-9活化水平，Bax/Bcl-2比值比較圖3 結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較， 模型對(duì)照組大鼠腦組織cleaved Caspase- 3/Caspase- 3、 cleaved Caspase- 9/Caspase-9、Bax/Bcl-2比值明顯上調(diào)（均P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，薯蕷皂苷低、中、高劑量組的cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2比值明顯下調(diào)（均P＜0.05）。

圖2 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況比較（TUNEL法）Figure 2 Comparison of the apoptosis of neurons in brain tissue of rats in various groups（by TUNEL assay）

圖3 各組大鼠腦組織中Caspase-3、Caspase-9活化水平，Bax/Bcl-2比值比較Figure 3 Comparison of the activated levels of Caspase-3，Caspase-9 and ratio of Bax/Bcl-2 in brain tissue of rats in various groups

2.5各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10含量比較表2結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清中的IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10 含量明顯升高（均P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，薯蕷皂苷中、高劑量組的血清中IL-6、TNF-α 和IL-1β 含量明顯降低，IL-10 含量明顯升高（均P＜0.05）。

2.6各組大鼠腦組織ICAM-1表達(dá)比較圖4 結(jié)果顯示：正常對(duì)照組細(xì)胞無特異染色。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組細(xì)胞中的ICAM-1陽性表達(dá)增強(qiáng)（細(xì)胞呈棕黃色），ICAM-1陽性表達(dá)細(xì)胞率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，薯蕷皂苷中、高劑量組中的細(xì)胞ICAM-1陽性表達(dá)明顯減弱，ICAM-1 陽性表達(dá)細(xì)胞率降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10含量比較Table 2 Comparison of the serum contents of IL-6，TNF-α，IL-1β，IL-10 of rats in various groups [ ± s，ρ/（pg·mL-1）]

表2 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10含量比較Table 2 Comparison of the serum contents of IL-6，TNF-α，IL-1β，IL-10 of rats in various groups [ ± s，ρ/（pg·mL-1）]

①P ＜0.05，與正常對(duì)照組比較；②P ＜0.05，與模型對(duì)照組比較

組別正常對(duì)照組模型對(duì)照組薯蕷皂苷低劑量組薯蕷皂苷中劑量組薯蕷皂苷高劑量組N/只10 10 10 10 10 IL-6 22.43 ± 4.16 92.08 ± 10.08①87.63 ± 11.54 53.33 ± 7.04②37.17 ± 6.82②TNF-α 38.28 ± 4.82 184.06 ± 22.26①176.47 ± 27.22 102.86 ± 10.06②68.33 ± 9.22②IL-1β 19.25 ± 3.01 113.17 ± 17.08①108.83 ± 21.31 77.16 ± 9.15②39.21 ± 5.87②IL-10 2.08 ± 0.24 3.22 ± 0.35①3.65 ± 0.43 6.18 ± 0.49②11.53 ± 1.56②

圖4 各組大鼠腦組織ICAM-1表達(dá)比較Figure 4 Comparison of the ICAM-1 expression in brain tissue of rats in various groups

圖5 各組大鼠腦組織HMGB1/TLR4/NF-κB p65通路的活化情況比較Figure 5 Comparison of the activation of HMGB1/TLR4/NF-κB p65 pathway of rats in various groups

2.7各組大鼠腦組織HMGB1/TLR4/NF-κB p65通路的活化情況比較圖5結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的HMGB1、TLR4相對(duì)蛋白表達(dá)水平與p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值均顯著升高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，薯蕷皂苷低、中、高劑量組的HMGB1、TLR4相對(duì)蛋白表達(dá)水平與p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值均顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

腦出血發(fā)生后會(huì)產(chǎn)生一系列繼發(fā)的神經(jīng)損傷，如腦水腫、細(xì)胞凋亡等，其中，腦出血周圍水腫是腦出血最常見的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙的主要原因[14]。本研究中組織干濕質(zhì)量法結(jié)果顯示，模型對(duì)照組的腦含水量較正常對(duì)照組明顯增多（P＜0.05），表明急性腦出血大鼠繼發(fā)了腦水腫；薯蕷皂苷中、高劑量組的腦含水量較模型對(duì)照組明顯減少（P＜0.05），表明薯蕷皂苷可減輕并緩解急性腦出血引起腦水腫的情況。本研究中神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果顯示，模型對(duì)照組的神經(jīng)損傷評(píng)分及腦指數(shù)較正常對(duì)照組明顯增高（P＜0.05），表明急性腦出血引起了大鼠的神經(jīng)功能障礙；薯蕷皂苷中、高劑量組的神經(jīng)功能評(píng)分及腦指數(shù)較模型對(duì)照組明顯降低（P＜0.05），表明薯蕷皂苷能夠修復(fù)急性腦出血大鼠的神經(jīng)損傷。

細(xì)胞凋亡在腦出血血腫周圍組織神經(jīng)細(xì)胞的變性、死亡的過程中扮演了重要角色[15]。在凋亡過程中，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf-1）結(jié)合，使其形成多聚體，并促使Caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，Caspase-9 被激活[16]，被激活的Caspase-9 激活Caspase-3 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。Bax 蛋白和Bcl-2 蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中同樣起到關(guān)鍵的作用，細(xì)胞趨于存活還是發(fā)生凋亡取決于Bax/Bcl-2蛋白比率，此比率增高，細(xì)胞趨向于凋亡，比率降低則細(xì)胞趨向于存活[18]。本研究TUNEL 染色結(jié)果顯示，模型對(duì)照組凋亡細(xì)胞較正常對(duì)照組明顯增多，薯蕷皂苷中、高劑量組凋亡細(xì)胞較模型對(duì)照組明顯減少（均P ＜0.05），且Western Blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組的Caspase-3、Caspase-9活化水平與Bax/Bcl-2 比值較正常對(duì)照組明顯上調(diào)，薯蕷皂苷各劑量組的Caspase-3、Caspase-9活化水平與Bax/Bcl-2比值較模型對(duì)照組明顯下調(diào)（均P ＜0.05）。表明急性腦出血可誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，薯蕷皂苷能夠抑制大鼠急性腦出血后的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

炎性反應(yīng)在腦出血的病理生理中的重要性越來越受到重視。腦出血炎性反應(yīng)是腦出血后引起神經(jīng)損傷的重要原因[19-20]。本研究ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組血清中的IL-6、TNFα、IL-1β、IL-10含量較正常對(duì)照組明顯升高（P ＜0.05），表明急性腦出血誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，激活體內(nèi)免疫應(yīng)答；薯蕷皂苷中、高劑量組的血清中IL-6、TNF- α 和IL-1β 含量 較 模 型對(duì)照 組 明 顯降低，IL-10 含量較模型對(duì)照組明顯升高（均P ＜0.05），表明薯蕷皂苷能夠調(diào)節(jié)急性腦出血大鼠機(jī)體的炎癥反應(yīng)。

ICAM-1是一種廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的黏附因子，其能夠影響白細(xì)胞黏附、活化，并介導(dǎo)神經(jīng)組織的炎癥反應(yīng)[21]。有研究顯示，急性腦出血患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)增加，炎癥因子能夠通過血腦屏障進(jìn)入腦組織，進(jìn)而上調(diào)ICAM-1 的表達(dá)[22]。本研究免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組細(xì)胞中的ICAM-1陽性表達(dá)較正常對(duì)照組增強(qiáng)（P ＜0.05），表明急性腦出血可誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)；薯蕷皂苷中、高劑量組中的細(xì)胞ICAM-1陽性表達(dá)較模型對(duì)照組明顯減強(qiáng)（P ＜0.05），表明薯蕷皂苷能夠減輕急性腦出血大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。

HMGB1 是一種新型促炎因子，能夠引起其他炎癥因子如TNF-α和IL-6 等表達(dá)，引發(fā)炎性瀑布反應(yīng)[23]。HMGB1 發(fā)揮細(xì)胞外促炎因子的作用主要是通過與晚期糖基化終產(chǎn)物受體和Toll 樣受體家族的TLR4等受體結(jié)合，啟動(dòng)相關(guān)信號(hào)途徑而刺激NF-κB 發(fā)揮致炎效應(yīng)。NF-κB p65 是NF-κB 的一種亞基組成形式，是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子[24]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB 的活化能夠誘導(dǎo)白細(xì)胞黏附分子上調(diào)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β 和IL-6 等促炎癥細(xì)胞因子，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[25]。腦出血患者HMGB1/TLR4/NF-κB p65 通路呈現(xiàn)被激活的狀態(tài)[26]。有研究[27]認(rèn)為通過抑制HMGB1誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及下游通路，能夠抑制腦出血引起的神經(jīng)損傷。本研究Western Blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組的HMGB1、TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值較正常對(duì)照組均顯著升高（P ＜0.05），表明急性腦出血引起了腦組織HMGB1/TLR4/NF-κBp65 通路的活化，激活炎癥反應(yīng)；薯蕷皂苷各劑量組的HMGB1、TLR4 蛋白相對(duì)表達(dá)水平，p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值均較模型對(duì)照組顯著降低（P ＜0.05），表明薯蕷皂苷能夠抑制急性腦出血大鼠腦組織HMGB1/TLR4/NF-κB p65 通路，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建老年SD 大鼠急性腦出血模型，發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷可能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB p65 通路，進(jìn)而抑制大鼠血灶周圍神經(jīng)細(xì)胞的凋亡與神經(jīng)組織的炎癥反應(yīng)，從而減輕急性腦出血。該結(jié)果可為薯蕷皂苷的綜合利用及開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，但其相關(guān)機(jī)制尚需深入研究。