玄梔顆粒對甲狀腺功能亢進(jìn)癥大鼠的藥效學(xué)及急性毒性實驗的研究

周宇清， 黃淑玲， 張慧芬， 杜群， 李燕舞

（1.東莞市中醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東東莞 523003；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃病研究所，廣東廣州 510405）

甲狀腺功能亢進(jìn)癥，簡稱甲亢，為內(nèi)分泌系統(tǒng)常見病、多發(fā)病，是指由多種原因引起的甲狀腺激素增多所導(dǎo)致的臨床綜合征，以甲狀腺腫大、突眼癥、基礎(chǔ)代謝增加為主要特征[1]。玄梔顆粒為東莞市中醫(yī)院黃淑玲主任臨床經(jīng)驗方，能顯著緩解甲亢早期陰虛陽亢、肝火上炎證型患者的臨床癥狀和體征，有效降低游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）與游離四碘甲狀腺原氨酸（FT4）水平。為進(jìn)一步闡明其功效，本研究觀察該方的主要藥效作用及急性毒性作用，以期為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物105 只SPF 級雌性SD 大鼠，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（粵）2013-0034。40 只SPF 級NIH 小鼠，雌雄各半，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（粵）2013-0002。實驗單位及場地：廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SYXK（粵）2013-0002。

1.2藥物、試劑與儀器玄梔顆粒，由玄參、生地黃、麥冬、梔子、醋鱉甲、生牡蠣、浙貝母、蒲公英8 味中藥組成，為東莞市中醫(yī)院院內(nèi)制劑（批號：20170911），成人日用量：每次10 g，每天2 次。優(yōu)甲樂片（左甲狀腺素鈉）、甲巰咪唑片，由德國Merck Serono 公司生產(chǎn)， 批號分別為237633、232285。大鼠三碘甲狀腺原氨酸（T3）、四碘甲狀腺原氨酸（T4）、FT3、FT4、促甲狀腺激素（TSH）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）檢測試劑盒，大鼠環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）、促甲狀腺激素受體抗體（TRAb）ELISA 檢測試劑盒，均由美國Abbkine 公司生產(chǎn)。湘儀TDZ5-WS 離心機(jī)、DKZ-1電熱恒溫震蕩水槽（上海一恒科技有限公司）；CENios酶標(biāo)儀（瑞士TECAN公司）。

1.3分組、造模、給藥及采樣大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，篩選后按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為7 組：空白對照組、模型對照組、玄梔顆粒中劑量組、玄梔顆粒低劑量+甲巰咪唑組、玄梔顆粒中劑量+ 甲巰咪唑組、玄梔顆粒高劑量+甲巰咪唑組、甲硫咪唑?qū)φ战M。其中，空白對照組和模型對照組各15 只，其余各組12 只。除空白對照組外，其余6 組大鼠均灌胃給予優(yōu)甲樂500 μg/kg，每天1次，連續(xù)28 d，制備甲亢模型[2]。

造模第8 天開始，各給藥組給予對應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)28 d。其中：玄梔顆粒低、中、高劑量分別為1.67、3.33、6.67 g/kg，相當(dāng)于成人日用劑量的5、10、20倍[3]；甲巰咪唑劑量為5.00 mg/kg，相當(dāng)于成人日用劑量的10 倍。模型對照組與空白對照組平行給予蒸餾水[2-4]。

期間每天記錄大鼠飲水量與進(jìn)食量并觀察大鼠狀態(tài)，每周測量體溫和體質(zhì)量1 次。末次給藥后，用100 g/L水合氯醛0.3 mL/100 g（體質(zhì)量）腹腔注射進(jìn)行麻醉，腹主動脈采血。摘取甲狀腺存于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液中，待作病理切片。

1.4甲狀腺病理觀察甲狀腺病理切片由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科制備。光鏡下進(jìn)行觀察，對甲狀腺濾泡形態(tài)、腫大情況，濾泡膠質(zhì)缺損情況，濾泡間質(zhì)水腫情況及上皮細(xì)胞增生情況等4個方面的病理改變進(jìn)行評分。甲狀腺濾泡形態(tài)：濾泡大小形態(tài)正常，計0 分；濾泡輕微腫大、大小形態(tài)一致，計1 分；濾泡明顯腫大、大小形態(tài)不一致，計2 分；濾泡明顯腫大、明顯增生、大小形態(tài)不一致，計3 分。濾泡內(nèi)膠質(zhì)缺損：染色均勻，計0 分；膠質(zhì)缺損＜30%，計1分；膠質(zhì)缺損＜50%，計2分；膠質(zhì)缺損＞50%，計3分。濾泡間質(zhì)水腫：無水腫，計0分；部分間質(zhì)水腫，計1分；全部間質(zhì)水腫，計2分。上皮細(xì)胞增生：無增生，計0分；輕微增生，計1分；增生明顯，計2分[5]。

1.5 ELISA法檢測外周血T3、T4、FT3、FT4、TSH、TRAb、cAMP、cGMP水平用無菌采血管腹主動脈采血，采血后靜置30 min，以3 000 r/min離心15 min，收集上層血清，保存于-80 ℃待測。具體操作方法按ELISA 試劑盒說明書操作。應(yīng)用酶標(biāo)儀于波長595 nm處檢測。

1.6急性毒性實驗40只NIH小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為正常組與給藥組，每組20 只，雌雄各半。給藥組每日間隔6 h 分2 次給予16.7 g/kg玄梔顆粒灌胃（累計給藥量相當(dāng)于成人日用劑量的100 倍），正常組給予等體積水灌胃，連續(xù)觀察2 周，記錄不良反應(yīng)及死亡發(fā)生情況。2 周后解剖小鼠，觀察內(nèi)臟異常變化。給藥前及解剖前均測量并記錄各組體質(zhì)量。

1.7統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析和t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1玄梔顆粒對甲亢大鼠模型整體表現(xiàn)的作用實驗期間，由于造模因素作用，模型對照組大鼠死亡3 只，玄梔顆粒中劑量組、甲巰咪唑?qū)φ战M各死亡1只，玄梔顆粒低劑量+ 甲巰咪唑組、玄梔顆粒中劑量+ 甲巰咪唑組、玄梔顆粒高劑量+ 甲巰咪唑組各死亡2只。造模后，與空白對照組比較，模型大鼠明顯消瘦，大小便增多，活動增多，易激惹，體質(zhì)量下降，飲水量、進(jìn)食量增多，體溫升高，符合甲亢的整體表現(xiàn)，提示造模成功[5]。各給藥組第2周給藥起體質(zhì)量均較模型對照組增加，進(jìn)食量、飲食減少。給藥3 周后，與模型對照組比較，玄梔顆粒中劑量組、玄梔顆粒中劑量+甲巰咪唑組、玄梔顆粒高劑量+甲巰咪唑組、甲巰咪唑?qū)φ战M食量、飲水量顯著下降，體質(zhì)量增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。具體結(jié)果見表1。本部分實驗結(jié)果說明，玄梔顆粒對甲亢模型大鼠的整體表現(xiàn)有一定的改善作用。

表1 玄梔顆粒對甲亢大鼠模型體質(zhì)量、飲水量、食量的作用Table 1 Effects of Xuanzhi Granules on body mass，water intake，food intake in hyperthyroidism model rats （ ± s）

表1 玄梔顆粒對甲亢大鼠模型體質(zhì)量、飲水量、食量的作用Table 1 Effects of Xuanzhi Granules on body mass，water intake，food intake in hyperthyroidism model rats （ ± s）

①P ＜0.05，②P ＜0.01，與空白對照組比較；③P ＜0.05，④P ＜0.01，與模型對照組比較

組別空白對照組模型對照組玄梔顆粒中劑量組玄梔顆粒低劑量+甲巰咪唑組玄梔顆粒中劑量+甲巰咪唑組玄梔顆粒高劑量+甲巰咪唑組甲巰咪唑?qū)φ战MN/只15 12 11 10 10 10 11體質(zhì)量（m/g）治療前197.5 ± 12.8 199.8 ± 11.1 197.7 ± 12.2 198.0 ± 12.0 196.5 ± 13.0 199.2 ± 12.9 196.5 ± 14.0治療后253.5 ± 15.3 223.8 ± 11.1②239.1 ± 11.3③234.6 ± 14.1 232.2 ± 10.2③244.6 ± 20.5③235.8 ± 14.7③飲水量（V/mL）治療前40.89 ± 3.67 44.20 ± 4.51 41.39 ± 5.68 42.64 ± 4.80 41.76 ± 4.06 43.11 ± 9.14 41.01 ± 7.77治療后42.60 ± 3.41 59.17 ± 8.20①49.88 ± 7.10③52.99 ± 7.61 49.22 ± 6.38③47.73 ± 3.97④48.51 ± 4.58③食量（m/g）治療前15.83 ± 1.39 17.7 ± 2.69 16.09 ± 1.13 16.16 ± 1.56 16.27 ± 1.47 16.15 ± 1.56 16.76 ± 2.47治療后18.53 ± 0.71 24.13 ± 1.40②22.55 ± 2.29③22.23 ± 1.19③21.55 ± 1.35④20.66 ± 1.60④21.45 ± 2.17③

2.2玄梔顆粒對甲亢大鼠甲狀腺病理改變的作用圖1結(jié)果顯示：空白對照組甲狀腺濾泡大小較一致，形態(tài)正常，濾泡內(nèi)膠質(zhì)均勻，部分可見少量小的吸收空泡，濾泡上皮細(xì)胞呈扁平狀，未見增生，濾泡間質(zhì)無水腫。模型對照組濾泡腫大，大小形態(tài)不一致，濾泡內(nèi)膠質(zhì)稀少，淡染，濾泡腔邊緣可見較多吸收空泡，膠質(zhì)缺損＜30%，濾泡上皮細(xì)胞輕度增生，上皮呈立方狀，部分濾泡間質(zhì)水腫。與模型對照組比較，玄梔顆粒中劑量組濾泡大小較一致，濾泡內(nèi)吸收空泡較少，膠質(zhì)缺損較輕，濾泡間質(zhì)水腫較輕。表2 結(jié)果顯示：與模型對照組比較，玄梔顆粒中劑量組、玄梔顆粒高劑量+甲巰咪唑組、甲巰咪唑?qū)φ战M甲狀腺病理評分顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。表明玄梔顆粒對甲亢大鼠甲狀腺病理改變具有改善作用。

圖1 玄梔顆粒對甲亢大鼠甲狀腺病理改變的作用（HE染色，×100）Figure 1 Effects of Xuanzhi Granules on hyroid pathological changes in hyperthyroidism model rats（by HE staining，×100）

表2 玄梔顆粒對甲亢大鼠甲狀腺病理評分的作用Table 2 Effects of Xuanzhi Granules on the pathological scores in hyperthyroidism model rats （ ± s，s/分）

表2 玄梔顆粒對甲亢大鼠甲狀腺病理評分的作用Table 2 Effects of Xuanzhi Granules on the pathological scores in hyperthyroidism model rats （ ± s，s/分）

①P ＜0.01，與空白對照組比較；②P ＜0.05，③P ＜0.01，與模型對照組比較

組別空白對照組模型對照組玄梔顆粒中劑量組玄梔顆粒低劑量+甲巰咪唑組玄梔顆粒中劑量+甲巰咪唑組玄梔顆粒高劑量+甲巰咪唑組甲巰咪唑?qū)φ战MN/只15 12 11 10 10 10 11病理評分1.20 ± 1.52 6.67 ± 1.78①4.50 ± 1.38③5.82 ± 0.98 5.72 ± 1.00 4.82 ± 0.98③5.25 ± 1.36②

2.3玄梔顆粒對甲亢大鼠血清甲狀腺激素T3、T4、FT3、FT4與促甲狀腺激素TSH水平的作用及對血清TRAb水平的作用表3 結(jié)果顯示：與空白對照組比較，模型對照組外周血血清T3、T4、FT3、FT4 濃度升高，TSH 濃度下降（均P＜0.01）。與模型對照組比較，玄梔顆粒中劑量組、玄梔顆粒中劑量+甲巰咪唑組、玄梔顆粒高劑量+甲巰咪唑組、甲巰咪唑?qū)φ战MT3、T4、FT3、FT4水平降低，TSH 水平升高（P＜0.05 或P＜0.01）。表明玄梔顆粒能降低甲亢大鼠血清甲狀腺激素水平。各組大鼠血清TRAb水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4玄梔顆粒對甲亢大鼠血清中cAMP、cGMP水平的作用表4 結(jié)果顯示：與空白對照組比較，模型對照組外周血血清cAMP 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型對照組比較，玄梔顆粒中劑量+甲巰咪唑組、玄梔顆粒高劑量+甲巰咪唑組和甲巰咪唑組外周血血清cAMP 水平顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）；各組血清cGMP 水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 玄梔顆粒對甲亢大鼠血清中T3、T4、FT3、FT4、TSH、TRAb水平的作用Table 3 Effects of Xuanzhi Granules on T3，T4，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4，TSH and TRAb in hyperthyroidism model rats （ ± s）

表3 玄梔顆粒對甲亢大鼠血清中T3、T4、FT3、FT4、TSH、TRAb水平的作用Table 3 Effects of Xuanzhi Granules on T3，T4，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4，TSH and TRAb in hyperthyroidism model rats （ ± s）

①P ＜0.01，與空白對照組比較；②P ＜0.05，③P ＜0.01，與模型對照組比較

組別空白對照組模型對照組玄梔顆粒中劑量組玄梔顆粒低劑量+甲巰咪唑組玄梔顆粒中劑量+甲巰咪唑組玄梔顆粒高劑量+甲巰咪唑組甲巰咪唑?qū)φ战MN/只15 12 11 10 10 10 11 T3[ρ/（ng·mL-1）]0.88 ± 0.26 1.65 ± 0.39①1.30 ± 0.35②1.60 ± 0.22 1.57 ± 0.37②1.23 ± 0.49②1.24 ± 0.47②T4[ρ/（ng·mL-1）]33.7 ± 10.1 59.1 ± 16.7①45.3 ± 9.6②54.9 ± 9.1 44.4 ± 9.4②43.0 ± 8.8③43.5 ± 11.7②FT3[c/（pmol·L-1）]3.98 ± 0.65 6.01 ± 1.31①5.03 ± 1.15②5.61 ± 0.99 4.73 ± 0.84②4.80 ± 0.65②4.84 ± 0.69②FT4[c/（pmol·L-1）]40.1 ± 8.0 63.2 ± 13.9①50.5 ± 11.3②53.6 ± 10.6 54.8 ± 10.4 46.5 ± 10.0③49.0 ± 9.5③TSH[J/（MIU·L-1）]1.12 ± 0.37 0.71 ± 0.10①0.83 ± 0.15②0.81 ± 0.16 0.87 ± 0.12③0.85 ± 0.20②0.85 ± 0.15②TRAb[J/（U·mL-1）]7.62 ± 0.88 7.42 ± 0.95 7.40 ± 0.91 7.73 ± 0.85 7.62 ± 1.03 7.71 ± 0.85 7.36 ± 0.93

表4 玄梔顆粒對甲亢大鼠血清中cAMP、cGMP水平的作用Table 4 Effects of Xuanzhi Granules on the serum levels of cAMP and cGMP in hyperthyroidism model rats （ ± s）

表4 玄梔顆粒對甲亢大鼠血清中cAMP、cGMP水平的作用Table 4 Effects of Xuanzhi Granules on the serum levels of cAMP and cGMP in hyperthyroidism model rats （ ± s）

①P ＜0.01，與空白對照組比較；②P ＜0.05，③P ＜0.01，與模型對照組比較

組別空白對照組模型對照組玄梔顆粒中劑量組玄梔顆粒低劑量+甲巰咪唑組玄梔顆粒中劑量+甲巰咪唑組玄梔顆粒高劑量+甲巰咪唑組甲巰咪唑?qū)φ战MN/只15 12 11 10 10 10 11 cAMP[ρ/（pg·mL-1）]87.4 ± 20.1 56.3 ± 10.9①66.0 ± 14.3 59.7 ± 9.3 68.4 ± 12.7②76.0 ± 12.3③66.1 ± 8.3②cGMP[c/（nmol·mL-1）]1.18 ± 0.27 1.22 ± 0.23 1.19 ± 0.27 1.32 ± 0.13 1.28 ± 0.19 1.22 ± 0.20 1.30 ± 0.20

2.5玄梔顆粒的小鼠急性毒性試驗各組均未見明顯不良反應(yīng)，2周后無小鼠死亡，體質(zhì)量增長正常。2周后解剖小鼠，各組小鼠均未見明顯臟器異常。給藥前與給藥2周后，給藥組體質(zhì)量增加與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。表明玄梔顆粒在較大劑量時無明顯急性毒性。

3 討論

甲狀腺毒癥是指血循環(huán)中甲狀腺激素過多，引起以神經(jīng)、循環(huán)、消化等系統(tǒng)興奮性增高和代謝亢進(jìn)為主要表現(xiàn)的一組臨床綜合征[1]。其中，由于甲狀腺腺體本身功能亢進(jìn)，合成和分泌甲狀腺激素增加所導(dǎo)致的甲狀腺毒癥稱為甲亢[1]。甲狀腺激素包括T3和T4，以T4為主。由甲狀腺上皮細(xì)胞合成釋放入血后，部分T3、T4 和甲狀腺素結(jié)合球蛋白結(jié)合，另一部分則以游離狀態(tài)在血中運輸，為FT3 和FT4。T3、T4、FT3 和FT4 是反映甲狀腺功能的最主要指標(biāo)，通常甲亢者T3、T4、FT3、FT4 水平升高[6]。TSH 是由垂體分泌的激素，能與甲狀腺上皮細(xì)胞上的促甲狀腺激素受體結(jié)合，促進(jìn)甲狀腺激素的合成與分泌。TSH是國際上公認(rèn)的診斷甲亢的首選指標(biāo)，在甲亢中，由于血清甲狀腺激素的增多，負(fù)反饋抑制了垂體TSH 的分泌，引起血清TSH水平下降[6]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為 “癭病” 是以頸部前、喉結(jié)兩旁出現(xiàn)腫大結(jié)塊為主要特征的一類病證，而甲亢患者多伴有甲狀腺腫，故把甲亢歸屬于 “癭病” 范疇[7]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為甲亢主要有肝郁氣滯、陰虛陽亢、氣滯痰凝、氣陰兩虛、血脈瘀阻等證型[8-12]。黃淑玲主任運用中西醫(yī)結(jié)合治療甲亢經(jīng)驗豐富，經(jīng)多年臨床觀察，認(rèn)為情志內(nèi)傷和體質(zhì)因素是甲亢的重要病因，總結(jié)多年治療甲亢的臨床經(jīng)驗，認(rèn)為甲亢以陰虛為本，情志內(nèi)傷是重要誘因，對甲亢早期辨證為陰虛陽亢、肝火上炎證，強(qiáng)調(diào)因虛而致實，確立以養(yǎng)陰清熱為主，輔以潛陽散結(jié)為治法，自創(chuàng)玄梔顆粒，臨床療效確切[13]。

本研究采用優(yōu)甲樂（左甲狀腺素鈉）灌服構(gòu)建甲亢大鼠模型，觀察玄梔顆粒的主要藥效作用及急性毒性作用。左甲狀腺素鈉是人工合成的四碘甲狀腺素原氨酸鈉，經(jīng)口服吸收入血后，能轉(zhuǎn)化成T4 并發(fā)揮甲狀腺激素的功能，大量灌服會引起血清甲狀腺激素水平升高并產(chǎn)生甲亢癥狀。本研究結(jié)果顯示，灌服優(yōu)甲樂后，模型大鼠出現(xiàn)了典型的甲亢表現(xiàn)，且血清T3、T4、FT3、FT4水平升高，TSH 水平下降，與甲亢的生化指標(biāo)變化一致。給予玄梔顆?；蚣讕€咪唑能顯著降低血清T3、T4、FT3、FT4 水平并升高血清TSH 水平，改善大鼠整體表現(xiàn)。玄梔顆粒與甲巰咪唑聯(lián)用時，量效關(guān)系良好，玄梔顆粒、甲巰咪唑單用也有明顯的治療作用。

甲亢可由Graves 病、多結(jié)節(jié)性甲狀腺腫伴甲亢、甲狀腺自主高功能腺瘤等多種病因引起，其中以Graves 病為主，占所有甲亢的85%左右[14]。Graves病的主要特征在于患者體內(nèi)存在針對TSH受體（TSHR）的特異性自身抗體（TRAb），其中的TSH受體刺激性抗體（即TSAb）與TSHR 結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，導(dǎo)致甲狀腺細(xì)胞的增生和甲狀腺激素的合成。TSAb 與TSHR 結(jié)合，可通過多條信號通路刺激甲狀腺上皮細(xì)胞合成與分泌甲狀腺激素。其中，cAMP 信號為最主要的細(xì)胞內(nèi)信號[15]。 在Graves 病 患 者 中， 由 于TSAb 激 活 了TSHR， 甲狀腺上皮細(xì)胞內(nèi)cAMP 信號水平升高[15-16]。中醫(yī)理論的現(xiàn)代研究認(rèn)為，甲亢等陰虛患者血中cAMP 升高， cGMP 降低，cAMP/cGMP 升高。cAMP/cGMP 被用作反映陰虛型甲亢的生化指標(biāo)[15，17]。本研究中采用外源性甲狀腺激素造模，未模擬Graves 病的病因。血清甲狀腺激素的增多負(fù)反饋抑制TSH分泌，同時又沒有TSAb的刺激，使得模型組中cAMP未有升高，反而隨著TSH的降低而降低，同時未觀察到cGMP有明顯變化。玄梔顆?；蚣讕€咪唑給藥后，隨著TSH的升高，cAMP水平升高。本研究中觀察到玄梔顆粒對甲亢大鼠血清cGMP無效果。

綜上所述，玄梔顆粒能改善甲亢模型大鼠的整體表現(xiàn)，降低甲亢模型大鼠外周血甲狀腺激素水平，亦對甲亢模型大鼠的膠質(zhì)缺損、濾泡間質(zhì)水腫等甲狀腺病理變化具有改善作用。急性毒性實驗中，無動物死亡，剖檢未見主要器官異常改變，提示藥物安全性好。