丹參酮ⅡA對大鼠腦缺血后PTEN-PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響

徐 璇，湯其強

PTEN蛋白是10號染色體上的磷酸酶，是胞內磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)的初級磷酸酶[1]，通過降低PI3K的磷酸化，減少信號通路蛋白激酶B(protein kinase B，PI3K)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的表達，參與細胞的增長、分化等多種功能[2]。研究[3]表明PTEN蛋白在腦缺血損傷后氧化增加，導致自噬通路PI3K/AKT/mTOR表達的增強，從而加重腦損傷。減少PTEN蛋白的氧化，對腦組織的保護具有重要意義。故尋找抑制PTEN氧化的新型藥物至關重要。丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA，TSA)是植物丹參的提取物，具有活血化瘀、清除氧自由基等功效，在臨床上常作為心腦血管疾病患者的治療用藥[4]。研究[5]表明TSA具有明確的調節自噬通路PI3K/AKT從而保護腦組織的作用。但是TSA對PTEN/PI3K信號通路的調節暫無研究。該研究擬探討TSA調節PTEN對大鼠腦缺血后自噬通路PI3K/AKT/mTOR的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料TSA購自美國Selleck公司，配比濃度為10 mg/kg[6]，術前連續灌胃4 d；6月齡健康雄性SD大鼠共80只，體質量230～280 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，標準飼養條件下喂養。PTEN(9188T)、AKT(4691T)、mTOR(3983T)抗體購自美國CST公司；PI3K(ab151549)抗體購自美國Abcam公司,濃度均為1 ∶1 000。

1.2 方法

1.2.1實驗分組 隨機將SD大鼠分為假手術組(10只)和手術組(70只)。假手術大鼠作為對照組標記為NC組；手術組大鼠再進行隨機分兩組，即給TSA藥組(TSA組)和給生理鹽水組(MCAO組)。根據大鼠拔線天數(1、3、7 d)不同，分別將手術組中TSA組第1天標記為T1，第3天標記為T3，第7天標記為T7;MCAO組分別對應為M1、M3、M7。

1.2.2腦缺血模型 根據Longa et al[7]線栓法制作大鼠腦缺血模型。手術操作簡述：10%水合氯醛麻醉，在大鼠頸部正中線處切1～2 cm切口，分離出大鼠右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，結扎頸外動脈遠心端。從頸外動脈近頸總動脈分叉處切一小口，插入魚線，魚線至頸內動脈深入距約2 cm感覺有阻力時，即已插至大腦中動脈，阻斷中動脈血流，達成栓塞條件。在栓塞2 h后拔魚線。根據不同組的要求，在拔線后1、3、7 d進行斷頭取腦。

1.2.3行為學評分 參照Longa et al[7]方法進行評分：0分：活動正常、無任何神經功能異常者；1分：不能完全伸展左側前爪者；2分：爬行見向左側追尾轉圈；3分：行走見身體向左側傾倒、偏癱；4分：不能自發行走且有意識障礙；納入者為1～3分。

1.2.4免疫組織化學 取完整腦組織，石蠟包埋，切片。用30 %過氧化氫封閉內源性過氧化物酶；山羊血清封閉非特異性蛋白；孵抗體；DAD顯色；復染、脫水、透明、封片。

1.2.5Western blot 斷頭取腦，選擇梗死側腦組織進行徹底勻漿提蛋白，確保組織完全裂解后收集上清液，即蛋白總溶液。配制SDS-PAGE電泳、上樣、轉模、孵抗體，曝光后將圖片存檔，用ImageJ軟件分析。

2 結果

2.1 Longa評分對造模成功的大鼠，根據Longa評分，對納入統計的TSA組和MCAO組大鼠的行為學進行評分統計。通過觀察對手術組大鼠的行為評分，從而間接表達大鼠神經功能受損情況。其中TSA組大鼠的行為學評分較MCAO組低(F=89.76，P<0.05)，且差異有統計學意義。見圖1。

圖1 各組大鼠的行為學評分情況

2.2 免疫組化檢測各蛋白表達水平免疫組織化學切片染色顯示：與NC組比較，手術組的各蛋白表達水平明顯改變：PTEN減少，PI3K、AKT、mTOR表達水平增加，隨著時間變化逐漸恢復；手術組中TSA組的PTEN表達增加，PI3K、AKT、mTOR表達降低。見圖2。

2.3 Western blot檢測各蛋白的表達與NC組比較，MCAO組PTEN蛋白表達減少，PI3K、AKT、mTOR表達增加，差異有統計學意義,與MCAO組比較，TSA組PTEN蛋白表達增加，PI3K、AKT、mTOR表達降低，第1天最明顯，差異有統計學意義(FPTEN=79.829,FPI3K=77.423,FAKT=42.400,FmTOR=27.896,P<0.05)，見圖3。

3 討論

隨著研究的不斷擴展，研究者發現PTEN蛋白在神經領域也不斷出現[8-9]：PTEN對神經細胞及腦組織的再生有影響，且PTEN蛋白的表達增加對缺血損傷后的組織具有保護作用。在腦缺血后激活自噬通路PI3K/AKT/mTOR，能夠加重腦組織的損傷，但是關于自噬信號的激活機制目前說法不一。隨著對蛋白PTEN的研究逐步加深，發現PTEN蛋白具有磷酸酶活性，能夠促進PI3K的磷酸化，能夠調節自噬通路的表達，對信號通路PI3K/AKT/mTOR具有重要的調節作用。本研究中，在大鼠發生腦缺血后，PTEN蛋白的表達減少，尤其是第1天較為明顯，隨時間變化逐漸回升，而自噬蛋白PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的表達明顯增加，在第1天出現峰值，隨著時間延長，蛋白表達水平逐漸恢復正常，差異有統計學意義；這一實驗結果表明在大鼠發生腦缺血后，機體PTEN蛋白的表達受抑制，從而減少PI3K的磷酸化，激活自噬通路PI3K/AKT/mTOR表達，加重腦組織損傷，驗證了腦缺血后PTEN蛋白的氧化能夠激活自噬信號通路PI3K/AKT/mTOR，PTEN蛋白具有調控自噬通路PI3K/AKT/mTOR的作用。

圖2 梗死側腦組織細胞免疫組織化學染色 ×200

圖3 Western blot 檢測各組PTEN、PI3K、 AKT、 mTOR蛋白表達與NC組比較：*P<0.05;與MCAO組比較：#P<0.05

TSA作為臨床常用藥物，在保護腦缺血方面具有肯定療效。作為中藥，TSA的治療機制暫無全面了解。前期的研究[4]發現，在大鼠腦缺血發生后，TSA通過調節自噬通路PI3K/AKT/mTOR的表達，減輕腦組織損傷，從而起到護腦的作用。關于TSA如何下調PI3K/AKT/mTOR的表達，目前暫無研究說明。本研究在TSA組的大鼠腦缺血發生后，PTEN蛋白的表達雖然呈下降趨勢，但與MCAO組比較，幅度明顯小，PI3K/AKT/mTOR蛋白表達的增加趨勢較小，再一次驗證了TSA有下調自噬信號通路表達的作用。而TSA能夠促進PTEN蛋白的表達，從而通過減輕自噬通路PI3K/AKT/mTOR的過度表達，減輕腦缺血后導致的腦組織損傷。再結合大鼠的行為學評分，TSA組的行為學評分較MCAO組低，在手術后第1天明顯，且差異有統計學意義(P<0.05)，表明TSA治療大鼠腦缺血具有臨床意義。