利拉魯肽通過自噬及改善氧化應激緩解大鼠糖皮質激素性骨質疏松

楊 婧，楊麗娜，丁庭庭，鐘 興，潘天榮

糖皮質激素性骨質疏松(glucocortieoid-induce osteoporosis，GIOP)作為最常見的繼發性骨質疏松類型，在長期接受糖皮質激素(glucocorticoid，GC)治療的患者中發病率高達30%～50%，已成為一個十分嚴峻的全球健康問題[1]。胰高血糖素樣肽-1(glucagonlike peptide-1，GLP-1)是腸促胰素的一種，近年來一些研究顯示,它不但能夠作用于胰臟，與骨代謝也密切相關[2]。其類似物利拉魯肽對骨骼有正性作用，但是具體機制尚不明確[3]。該研究建立GIOP大鼠模型，使用利拉魯肽進行干預，通過分析骨密度(bone mineral density,BMD)、骨微結構、自噬(autophagy)及氧化應激(oxidative stress，OS)水平的變化，探討利拉魯肽對GIOP的影響，并初步討論其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 8周齡雄性SD大鼠30只，體質量(220±10) g，由安徽省實驗動物中心提供。飼養環境：標準鼠籠分籠飼養，每籠5只，溫度(23.0±2.0)℃，濕度(55±5)%，光照時間7：00～19：00，通風環境良好，每周更換2次墊料，每12 h添加飼料及水1次，不限制大鼠攝食及飲水。

1.1.2主要藥物、器材與試劑 地塞米松(石藥銀湖制藥有限公司)；利拉魯肽(丹麥諾和諾德公司)；活性氧(reactive oxygen species，ROS) 測定試劑盒、丙二醛(malonaldehyde， MDA) 測定試劑盒及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒(萬類生物公司) ；Beclin-1抗體、Atg5抗體、LC3B抗體、p62/SQSTM1W抗體及β-actin(碧云天生物公司)；Micro-CT(美國通用公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗動物分組及模型的建立 所有雄性SD大鼠適應性喂養1周后，采用數字表法隨機平均分為地塞米松組(DXM組)、地塞米松加利拉魯肽干預組(DXM+Lira組)及正常對照組(CON組)，每組各10只，全程藥物干預12周，具體方式如下：① CON組：給予0.1 ml生理鹽水每日肌肉注射；② DXM組：按照1 mg/kg劑量配置成0.1 ml地塞米松溶液每周2次肌肉注射;③ DXM+Lira組: 在相同劑量及頻率地塞米松溶液注射的同時，給予利拉魯肽200 μg/kg劑量每日皮下注射。每周定時對所有大鼠進行體質量測定，并根據其數值變化相應地調整藥物的使用劑量。

1.2.2樣本收集 于實驗12周末，使用10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，心房放血處死大鼠后收集雙側股骨，剔除全部附著肌肉、軟組織及骨髓，包裹生理鹽水紗布置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3Micro-CT檢測BMD、骨微結構 將左側股骨室溫下解凍后固定于樣品固定器內，以15 μm的分辨率行Micro-CT掃描并行組織結構重建。得到重建圖像后，使用自帶軟件定量分析得到BMD、骨小梁體積比率(bone volume/tissue volume，BV/TV)、骨小梁數量(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁間距(trabecular separation，Tb.Sp)和骨小梁連接密度(connectivity density, Conn.D)參數。

1.2.4試劑盒檢測骨組織氧化應激指標 取大鼠右側股骨遠端骨組織，放入液氮中反復研磨直至粉末狀，加入PBS后使用1 000g離心10 min收集上清液，按照說明書使用試劑盒測定ROS、SOD及MDA含量。

1.2.5蛋白免疫印跡(Western blot)分析自噬相關蛋白表達 取大鼠股骨遠端骨組織粉末，使用Western及IP細胞裂解液提取干骺端總蛋白，轉移至PVDF膜上后與特異性抗體孵育，曝光顯影后通過灰度分析Beclin-1、Atg5、p62/SQSTM1W及Map1-LC3-Ⅱ的表達水平。

2 結果

2.1 骨組織Micro-CT分析Micro-CT下股骨骨形態計量學結果顯示，與CON組比較，DXM組大鼠BMD降低，BV/TV下降，Tb.N減少，Tb.Th變薄，Tb.Sp增寬，連接變差，差異有統計學意義(P<0.05)；而在利拉魯肽干預下，DXM+Lira組較DXM組BMD增加，骨小梁變多變粗變密，連接改善，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 骨組織氧化應激水平變化與CON組比較，DXM組大鼠骨組織氧化應激產物ROS和MDA水平增加，抗氧化酶SOD水平下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與DXM組比較，DXM+Lira組大鼠骨組織ROS和MDA水平下降，SOD水平上升，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2 。

2.3 骨組織自噬水平變化與CON組比較，DXM組大鼠股骨遠端骨組織自噬相關蛋白Beclin-1、Atg5及Map1-LC3-Ⅱ表達水平上升，p62/SQSTM1W蛋白表達水平略有下降，差異有統計學意義(P<0.05)。與DXM組比較，DXM+Lira組Beclin-1、Atg5及Map1-LC3-Ⅱ的蛋白表達水平下降，p62/SQSTM1W蛋白表達水平略有上升，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

表1 鼠左側股骨Micro-CT結果

表2 股骨組織中氧化應激指標變化

圖1 大鼠骨組織Beclin-1、Atg5、p62 及LC3 Ⅱ的蛋白表達變化與CON組比較:*P<0.05；與DXM組比較:#P<0.05

3 討論

利拉魯肽是一種利用酵母生產的人工合成長效GLP-1類似物，與天然GLP-1具有97%的序列同源性，可通過多種方式作用于骨骼并具有保護作用[4]。Mansur et al[5]發現,在GIOP小鼠模型中,利拉魯肽可以預防骨丟失,延緩骨質疏松進程。另有研究[6]表明,利拉魯肽對于絕經后骨質疏松小鼠模型也有增加BMD,改善骨結構等作用。本研究及前期研究[7]結果與其一致,經Micro-CT掃描，DXM組的大鼠較CON組BMD下降，BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Conn.D下降，提示骨小梁變少變疏變細，骨質疏松模型造模成功。在利拉魯肽干預下，與DXM組比較，大鼠BMD增加，Tb.Th、Conn.D增加，提示骨小梁微結構得到改善，說明利拉魯肽可以增加BMD、防止骨微結構的破壞,對GIOP具有一定的改善作用。

氧化應激反應可以抑制成骨細胞分化并促進其凋亡,誘導破骨前體細胞的增殖分化并提高其活性，對維持骨代謝平衡十分重要[8]。在高劑量糖皮質激素誘導下,機體內產生的自由基水平高于細胞的抗氧化防御能力,過量的活性氧ROS存在于組織或細胞內將誘發氧化應激反應,并直接或間接導致氧化損傷。動物實驗表明[9]，相較對照組，GIOP家兔模型的BMD下降，血清自由基水平升高,抗氧化酶活性降低,當注射抗氧化劑干預后,可有效地逆轉上述改變。本研究結果與之相符，與CON組比較，DXM組大鼠骨組織氧化應激產物ROS、MDA水平均上升，抗氧化酶SOD水平下降，說明大鼠氧化應激水平升高，且出現了骨質疏松，其可能原因是地塞米松引起了氧化應激損傷從而導致了骨代謝失衡。在利拉魯肽干預下，相較于DXM組，大鼠氧化應激產物ROS、MDA水平均下降，抗氧化酶SOD水平上升，且BMD及骨微結構指標好轉，提示利拉魯肽可能通過改善氧化應激緩解大鼠GIOP的程度。

自噬對骨代謝及其相關重要細胞也有重要影響，適度的自噬可以使骨細胞保持功能，但是過度的自噬則會激活調亡或轉換為自噬性死亡導致骨代謝紊亂[10]。有研究[11]表明低劑量的GC可以誘導骨細胞自噬，具有保護作用；高劑量的GC會引起成骨細胞的凋亡，從而導致骨強度下降。本研究結果與之符合，DXM組大鼠較CON組自噬相關基因Beclin-1、Atg5及Map1-LC3-Ⅱ蛋白表達水平均升高,p62/SQSTM1W蛋白表達水平略有下降，并伴BMD下降，骨微結構破壞。相較于DXM組,利拉魯肽干預組自噬相關蛋白Beclin-1、Atg5及Map1-LC3-Ⅱ的表達水平下降,p62/SQSTM1W蛋白表達水平略有上升，且大鼠BMD增加，骨微結構改善，提示利拉魯肽可能通過調整自噬水平，改善大鼠BMD與骨微結構。

氧化應激反應與自噬對于骨代謝都十分重要，并且這兩者關系密切，互相作用。一方面，氧化應激的主要產物ROS可以通過多種機制促進自噬[12]。在自噬的誘導階段中，過量的ROS可以抑制PI3K-Akt-mTOR從而激活自噬。在自噬體形成過程中，ROS可以通過抑制Atg4的活性引起LC3-Ⅱ堆積，使得自噬體增多從而促進自噬。在饑餓條件下，細胞內產生的大量ROS可以氧化Atg4抑制LC3-Ⅱ去脂化從而保證自噬體延伸。ROS還能促進待降解物質的泛素化修飾，使待降解物與p62 及LC3-Ⅱ泛素化結合從而易于被自噬。另一方面，自噬可以抑制氧化應激及其造成的損傷[13]。作為氧化應激的直接引物，約90%的ROS產生于線粒體內膜呼吸鏈，持久嚴重的氧化應激將造成線粒體損傷從而產生更多的ROS。通過清除損傷的線粒體,自噬可以直接調控ROS水平。實驗[14]表明，用脂多糖刺激心肌細胞會產生大量ROS繼而損傷線粒體，通過線粒體自噬則能及時清除受損線粒體并降低ROS水平。此外，自噬還可以通過修復損傷的DNA以避免氧化應激造成的細胞死亡。有研究[15]表明，敲除自噬相關基因Beclin-1、Atg5及Atg7將導致DNA損傷累積，加速細胞死亡。

氧化應激對于自噬的調節功能呈現兩面性,自噬對于骨代謝也存在雙重影響。少量的ROS可以激活自噬，通過抑制氧化應激損傷自噬可以減少成骨細胞凋亡，大量的ROS則會導致過度自噬，從而激活凋亡或者轉換為自噬性死亡。因而在本研究中，DXM組自噬水平增高，但是并未通過提高自噬水平阻止BMD下降及骨微結構破壞，其可能原因是大劑量的地塞米松引起了氧化應激損傷并直接導致了骨代謝的失衡，氧化應激反應中產生的過量活性氧ROS又引起了過度自噬誘發成骨細胞凋亡從而進一步加劇了骨質疏松。在利拉魯肽干預下，大鼠骨組織內活性氧ROS以及脂質過氧化代謝產物MDA的表達減少,抗氧化酶SOD的活性增加，部分自噬相關蛋白表達降低，BMD及骨微結構改善，提示利拉魯肽可能是通過改善氧化應激水平并調整細胞自噬，從而起到緩解骨質疏松作用。

綜上所述，利拉魯肽改善由GC誘導的大鼠骨質疏松，推測其可能與改善氧化應激和調節自噬有關，但確切的作用機制還需進一步研究深入探討。