香煙煙霧提取物對可溶性內皮細胞蛋白C受體表達的影響

樊芳芳，胡曉蕓

蛋白C系統作為人體抗凝系統的重要組成部分，在血液中以無活性的酶原形式存在，保持正常機體凝血與抗凝功能平衡[1]，是體液抗凝的主要成分之一。蛋白C系統參與抗凝的不同階段，不僅影響蛋白C活化，而且抑制活化蛋白C活性[2-3]。Fukudome等[4]從內皮細胞表面分離出蛋白C和活化蛋白C的結合蛋白——內皮細胞蛋白C受體(endothelialcellprotein C receptor，EPCR)，其存在于細胞膜表面的跨膜蛋白，與蛋白C/活化蛋白C特異性結合后將其呈遞給鄰近的凝血酶/血栓調節蛋白復合物，使蛋白C活化效率提高5倍，同時參與調節血液凝固反應。EPCR有兩種存在形式，一種是內皮細胞表面的膜聯EPCR(mEPCR)，通過與蛋白C結合增強蛋白C/活化蛋白C活性，提高蛋白C活化率[5]，但其本身無任何直接的抗凝活性；另一種是存在于血漿的可溶性EPCR(sEPCR)，其作用是抑制蛋白C/活化蛋白C活性[5-6]。相關研究發現，血漿sEPCR升高可增加動靜脈血栓形成風險[6-7]。本研究將香煙煙霧提取物(CSE)作用于人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)，觀察CSE對sEPCR表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 HUVECs株為ATCC來源細胞株，購自上海門諜塔生物科技發展有限公司；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自杭州四季青公司；RPMI-1640培養基、HEPES、胰蛋白酶均購自Gibco；青霉素、鏈霉素均購自華北制藥股份有限公司；人sEPCR酶聯免疫吸附法測定(ELISA)試劑盒購自上海西唐公司。

1.2 CSE的制備 參照文獻[8]方法，將1個50 mL注射器驅動裝置連續抽吸兩支過濾嘴香煙，每支煙吸5 min，以-5 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)負壓持續吸引，經三通管另一負壓驅動出口將產生的煙霧溶于50 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)制成懸液[5]，將獲得的CSE溶液通過0.22 μm微孔濾膜過濾，以除去細菌和大顆粒。將CSE-PBS緩沖液以1 mol/L的NaOH調節pH值至7.4，并將獲得的儲備溶液濃度定義為100%的CSE，并使用PBS將溶液稀釋至實驗所需的最終濃度。每次實驗前立即準備CSE溶液。

1.3 HUVECs培養與分組 將含10%FBS的RPMI-1640培養液與HUVECs共同孵育，培養箱條件為37 ℃、5%CO2，48 h換液1次，觀察細胞生長狀態，當生長至亞融合狀態，以0.25%的胰蛋白酶消化液1∶2傳代，將傳代的細胞接種于培養板上，每孔約2 mL，待細胞約80%融合后可用于實驗[5]。實驗分為以下兩部分，①不同濃度CSE作用：分別將0%、2.5%、5.0%及10.0%的CSE與HUVECs共同孵育，8 h后收集各濃度組上清液。②同一濃度不同作用時間CSE對細胞的影響：將選出的5.0%CSE與HUVECs分別孵育0 h、4 h、8 h、12 h及24 h，并設立對照組，對照組采用相同體積的PBS同步培養，分別收集各組上清液。實驗需保證各組除處理因素外其余實驗條件均相同。每個樣本均設4個復孔，實驗重復3次[1]。

1.4 ELISA檢測sEPCR含量 sEPCR標準品濃度分別為4 000 pg/mL、2 000 pg/mL、1 000 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL，檢測過程嚴格按照試劑盒說明進行。

較采用單因素方差分析(ANOVA)及重復測量方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HUVECs形態觀察 倒置相差顯微鏡下觀察HUVECs，可見細胞大量貼壁生長，形態不規則，呈橢圓形、多角形、扁平或梭形，為單層鵝卵石鑲嵌樣排列，細胞單層融合時呈典型的“鋪路石”樣外觀。詳見圖1。

圖1 HUVECs顯微鏡下圖像

2.2 不同濃度CSE對HUVECs表達sEPCR的影響 HUVECs與不同濃度CSE孵育8 h后，5.0%、10.0%CSE組sEPCR較0%CSE組升高，差異有統計學意義(P<0.05)；2.5%CSE組與0%CSE組sEPCR比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組sEPCR比較(±s) 單位：pg/mL

2.3 同一濃度不同作用時間CSE對sEPCR的影響 顯微鏡下圖像可見10.0% CSE組大部分細胞已死亡，故本研究實驗采用5.0%CSE。5.0%CSE與HUVECs分別孵育0 h、4 h、8 h、12 h及24 h后，8 h、12 h及24 h sEPCR表達較對照組升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 同一濃度不同作用時間CSE對sEPCR的影響(±s) 單位：pg/mL

3 討 論

血管內皮是人體重要的組成部分，相關研究已發現其具有多種生理功能，可維持血管通透性、調節白細胞和血小板黏附、維持血管細胞增殖、抗凝等作用，血管內皮既是血液和組織之間的天然屏障，也是人體最大的自分泌和旁分泌器官[1，9]，能合成和分泌多種抗凝和促凝因子，對維持凝血系統的平衡具有直接或間接作用，是血栓形成中重要的調節物質。血管內皮對血液成分和血流變化敏感，較多因素和相關疾病如吸煙、高脂血癥、高血壓、糖尿病等均可引起血管內皮功能障礙[1，10-11]，導致凝血和纖溶功能失衡。其中吸煙是重要的危險因素之一。

香煙煙霧包含超過5 600個不同成分[12]，其中200多個確定為致癌物和呼吸道毒素。吸煙是心血管疾病的獨立危險因素，導致血管內血栓形成，與急性冠脈綜合征和心源性猝死發生率增加有關[13]。尸檢和臨床研究表明，吸煙對受損的內皮細胞具有直接毒性作用，對動脈血栓的形成有重要作用，導致止血系統改變，血小板反應性增加，與動脈粥樣硬化血栓形成有關[14-15]，血栓形成受抗凝和止血系統影響。然而，吸煙通過抗凝系統引起血栓形成的機制尚不清楚[16]。

血液凝血是一系列酶促連鎖反應過程，其中高分子激肽原、因子Ⅴ和因子Ⅷ是血液凝血過程的限速因素。蛋白C系統是針對因子Ⅴ和因子Ⅷ的抑制物，在人體抗凝過程中發揮重要作用，凝血酶激活凝血過程，引起血小板活化，與內皮細胞表面血栓調節蛋白結合后，啟動蛋白C抗凝系統。活化蛋白C一方面與輔因子蛋白S結合，滅活因子Ⅴa和Ⅷa，限制凝血酶產生；另一方面通過加速溶解組織纖維蛋白溶解酶原依賴性血凝塊，從而發揮纖溶作用。EPCR是體內蛋白C系統新發現的成員[17]，可選擇性地表達于大血管內皮細胞，不僅與蛋白C和活化蛋白C特異結合，提高蛋白C活化效率，還參與防御炎癥反應和抗凋亡等過程，是近年來發現的在炎癥和抗凝過程中具有重要意義的多功能糖蛋白[18]。EPCR分為兩種，一種是內皮細胞表面的膜聯EPCR，一種是血漿中sEPCR，兩者對蛋白C/活化蛋白C的親和力相同，但作用相反，sEPCR抑制蛋白C/活化蛋白C活性，抑制活化蛋白C對凝血因子Ⅴa和Ⅷ的滅活作用。

EPCR表達具有組織特異性，在胎盤、肝、肺和心肌組織呈高表達[1，19]，表明血管內皮細胞EPCR表達水平與組織發生血栓概率有關。故本研究選擇HUVECs作為細胞模型，通過觀察不同實驗條件CSE對體外培養的HUVECs表達sEPCR含量變化[1]，從細胞水平揭示吸煙對血管內皮凝血功能的影響[16，20]。有研究表明，CSE呈劑量依賴性降低HUVECs存活率[1，21]。本研究結果顯示，10.0%CSE組HUVECs存活率與0%CSE組相比明顯下降，而5.0%CSE對HUVECs存活率基本無影響，5.0%、10.0%CSE與細胞共同孵育后，與0%CSE組相比，上清液sEPCR明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，5.0%與10.0%CSE比較差異無統計學意義(P>0.05)，2.5%CSE組與0%CSE組相比，sEPCR表達下降，但差異無統計學意義(P>0.05)，說明高濃度CSE與細胞共同孵育后，引起內皮細胞部分死亡，而低濃度CSE對內皮細胞的損害不大，與以往研究結果[1，22]一致。因此，本研究采用5.0%CSE為最佳濃度，以最佳濃度CSE孵育細胞，觀察不同時間后sEPCR含量變化，結果顯示：隨著時間延長，上清液sEPCR含量逐漸增高，且不同時間5.0%CSE組sEPCR蛋白含量均高于對照組，其中8 h、12 h及24 h sEPCR表達較對照組升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示CSE對HUVECs表達sEPCR的影響在一定范圍內呈時間依賴性。

綜上所述，內皮細胞損傷與CSE作用密切相關，CSE導致sEPCR升高，抑制蛋白C/活化蛋白C活性，引起凝血功能障礙，從而導致血栓性疾病的發生，本研究為進一步探討血栓性疾病提供了實驗基礎。