腫瘤患者卵巢儲備功能受損機制及保護并促進生育力的研究進展

李 星綜述，蘇亦平審校

0 引 言

2018年全球新增癌癥患者1810萬例，其中女性癌癥患者860 萬例，發病率亞洲占47.5%，死亡率超50%，15 至44 歲女性患者超過127 萬，而乳腺癌發病率最高24.2%，宮頸癌發病率6.6%，卵巢癌發病率3.4%［1］。在過去的二十年里，癌癥治療技術的進步使年輕癌癥患者的存活率顯著提高。然而，目前的癌癥治療技術，尤其是化療和盆腔放療，對生殖功能有不利影響。Selter 等［2］對美國2009-2016年間接受手術和化療的18 781例女性癌癥患者進行了是否接受生育保存及咨詢服務的統計，結果顯示31.7%的人接受了保留生育能力的測評，保育率從2009年的1.0%上升到2016年的5.5%。可見雖然目前接受保育措施的人較少，但在逐年增加，表明生殖服務正開始成為育齡婦女腫瘤治療的一個更重要的方面。美國臨床腫瘤學會（American Society of Clinical Oncology，ASCO）建議腫瘤專家在診斷后不久即需要與年輕女性患者討論治療后不孕的風險與保留生育功能的選擇方法［3］。年輕癌癥患者的卵巢功能受損可導致為卵巢早衰，引起絕經期癥狀，如潮熱出汗、情緒不穩、泌尿生殖器萎縮、失眠、陰道干澀、骨質疏松等。卵巢儲備功能受損導致生殖功能下降和不孕，使患者身心健康受損發生家庭社會矛盾沖突。因此，腫瘤患者生育能力的保護及恢復一直受到業界廣泛關注，全世界正在努力建立腫瘤患者的生育力保護方案。

1 化療藥物對卵巢功能的損傷機制

卵巢儲備功能是指卵巢原始卵泡被激活后生長、發育、產生成熟的可受精卵母細胞的能力，代表女性生育水平。臨床上常用卵泡刺激素、雌二醇、抗苗勒管激素、卵巢體積及竇卵泡計數等來評估卵巢儲備功能。放化療是造成腫瘤患者卵巢儲備功能受損的最主要原因，而化療藥物引起卵巢損傷的相關機制至今尚未被充分揭示。細胞毒性化療藥物按作用方式主要分為七大類：烷化劑、鉑類衍生物、蒽環類抗生素、植物生物堿、抗代謝物、紫杉烷類和生物制劑。烷化劑的活性代謝產物與DNA 交聯，抑制DNA 的合成和功能。鉑衍生物共價結合DNA形成鏈內和鏈間交聯，導致DNA在復制過程中斷裂。蒽環類抗生素干擾DNA 轉錄，抑制拓撲異構酶Ⅱ及產生氧自由基導致DNA 斷裂。抗代謝物直接抑制DNA、RNA 的合成。生物堿和紫杉烷類在有絲分裂中抑制微管蛋白聚合并破壞微管蛋白組裝，干擾細胞有絲分裂。最終結果表現為原始卵泡被誘導激活、成熟卵母細胞凋亡以及對支持細胞（卵泡膜細胞和顆粒細胞）的損傷。

2 保護策略

2.1 藥物促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRH-a）較自然的GnRH 分子擁有更高的受體親和力和更低的酶降解能力，從而競爭性抑制GnRH 的生物活性。多項臨床試驗和薈萃分析表明，絕經前期婦女在接受化療期間使用GnRH-a 進行卵巢功能抑制，與未接受化療的患者相比，發生卵巢衰竭的可能性更小，月經恢復的幾率也更高［4-5］。然而，多項其他研究未能證實這些發現，如2011年的一項前瞻性隨機試驗中將60例年齡<46歲且激素不敏感乳腺癌患者隨機分配為接受蒽環類/環磷酰胺（有或無紫杉烷）新輔助化療，有或無戈舍瑞林組。結果顯示與僅接受化療的患者比較，接受戈舍瑞林同時接受現代新輔助化療的絕經前乳腺癌患者在化療結束后6個月閉經率并未明顯下降［6］。GnRH-a 理論上可能影響化療對雌激素敏感性腫瘤的療效，然而，這種對化療的負面影響尚未得到證實?；熎陂g使用卵巢抑制來保護卵巢功能的原理也尚不清楚，化療前應用GnRH對于卵巢功能的保護效果至今仍有爭議。因此，ASCO 最新更新的指南建議，GnRH 激動劑只在無法應用已證實具有生育能力保護的方法的年輕乳腺癌患者中使用［7］。

免疫調節劑AS101 抑制PI3K/PTEN/Akt 信號通路，雷帕霉素抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路［8］，均可減少原始卵泡的活化，從而降低環磷酰胺對卵巢儲備功能的損害［9］。神經酰胺-1-磷酸抑制卵泡發育和凋亡減少環磷酰胺誘導的卵巢損傷［10］。抑制糖原合成酶激酶-3 調節氧化應激減少多柔比星誘導的促性腺毒性［11］。褪黑激素抑制PTEN/AKT/FOXO3a信號通路中的磷酸化反應減少順鉑誘導的卵泡丟失［12］。鞘氨醇-1-磷酸通過鞘磷脂途徑抑制細胞凋亡減少卵泡丟失［13］。這些抑制活化和凋亡的藥物是否會對化療效果造成干擾，以及這些幸存下來的卵泡攜帶的基因是否正常有待進一步研究。

此外，有研究表明褪黑素能減少射線對大鼠卵巢功能的損傷，其機制可能與褪黑素抑制射線誘導的Caspase3激活有關［14］。

2.2 干細胞移植干細胞一直是一個研究熱點，包括胚胎干細胞和成體干細胞。成體干細胞是一種存在于已分化組織中的未分化細胞，廣泛存在于腦、骨髓、外周血、皮膚、肝及生殖腺等。其中原始生殖細胞（primordial germ cells，PGCs）、卵原干細胞（oogonial stem cells，OSCs）、微小胚 胎樣干細胞（very small embryonic-like stem cells，VSELs）和誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，IPSCs）在卵巢功能和生殖能力方面的研究較有代表性。

PGCs在發育過程中隨性腺嵴遷移，被認為也遷移到所有發育器官，并在各成年器官中存活，作為組織干細胞的后備池。諸多研究表明提供合適的生長因子混合物時，體外分離的雌性和雄性性腺PGCs均能進入第一次減數分裂前期，將減數分裂前期的雌性PGCs 與卵巢體細胞聚集重建卵巢，移植到同基因宿主的腎包膜或卵巢皮質中，能夠形成前腔和前腔濾泡，發育成減數分裂能力強甚至可受精的卵母細胞［15］。受孕后2個月人PGCs 分化為卵母細胞，受孕后6個月開始形成原始卵泡，因此成人卵巢中無PGCs。目前，從胚胎或臍帶中提取含有PGCs 的組織進行體內移植，或將PGCs 體外培育后移植回青春期前患者的性腺中，是比較有希望產生成熟卵子的方法［16］。胚胎干細胞的分離提取需要破壞人類胚胎，因而受到倫理限制。臍帶間充質干細胞（human umbilical cordmesenchymal stem cells，HuMSCs）因其來源于分娩后的臍帶而避免了這一局限，并且具有原材料數量多，潔凈度高，體外易分離培養，免疫原性低，利于異體移植，高分化潛能等優點。因此，HuMSCs 在臨床上具有更廣泛的應用前景。

因為新生兒卵巢中估計的卵母細胞數量遠多于成人排卵卵母細胞和閉鎖卵泡的數量之和，有人猜測卵巢中存在增殖性生殖細胞，在過去的二十年中，OSCs在成人卵巢中的存在一直是一個有爭議的話題。越來越多的研究發現了在小鼠、大鼠、牛、和成人的卵巢中OSCs 的存在［17］，但誘導分化OSCs 的機制尚不明確，也無證據表明生理條件下OSCs對原始卵泡池有貢獻。

因為分子量小，長期處于靜止狀態，不易被觀察者發現等原因，VSELs 自提出后其存在至今仍有爭議。VSELs 被認為是最原始的干細胞，普遍存在于成人所有器官中，因其在表觀遺傳學和發育上更成熟，VSELs易分化為三個胚層，并在體外自發產生精子和卵母細胞。在培養中不易分裂，也不會產生畸胎瘤或在發育中的胚胎內整合。這種相對靜止的特性使其能夠在各種毒性損傷中存活。腫瘤治療后存活的VSELs 可靶向誘導非功能性性腺的內源性再生，并且無相關的倫理或免疫排斥問題［18］。

IPSCs 是一類由Oct3/4，Sox2、c-Myc 和Klf4 這四種轉錄因子基因誘導體細胞發生轉化產生的，其在形態、基因和蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態、細胞倍增能力、畸胎瘤生成能力及分化能力等方面都與胚胎干細胞相似，但無倫理及免疫排斥問題。因易誘發線粒體基因突變而致癌等基因問題飽受爭議，其在再生醫學及生殖醫學領域仍有發展潛能［19］。

2.3 手術對于一些良性腫瘤患者，尤其是卵巢腫瘤，手術對卵巢功能的影響是最主要的，囊腫剝除術中直接丟失了部分正常卵泡及支持細胞，手術中熱損傷、血供減少、術后炎癥反應以及腹腔鏡手術中的CO2高暴露［20］等均會造成卵巢儲備功能受損。但有文章表明全子宮切除術及雙側輸卵管切除術并不會造成卵巢功能下降［21］。育齡期盆腔惡性腫瘤患者在接受盆腔照射前進行卵巢移位術是目前臨床上常用的減少放療對生育功能損害的手段［22］。常移位于圓韌帶基底部、結腸旁溝外側及腎下極水平，成功率與患者年齡、血管蒂長度位置、放療范圍時間等有關，術后嚴重并發癥是血供受損及輸卵管梗死。術后有可能出現卵巢囊腫，這是卵巢功能受損的標志［23］。然而，在大多數情況下，這些囊腫是不需要治療的。大量回顧性研究比較了腹腔鏡下卵巢囊腫剝除術中的三種常用止血方法：雙極電凝，超聲刀及縫扎止血在卵巢儲備功能方面的影響，發現縫扎止血影響較小，超聲刀或雙極電凝止血術影響較大，應謹慎使用止血電凝［24-25］。CO2激光消融法與傳統腹腔鏡卵巢囊腫剝除術相比對卵巢周圍組織損傷最?。?6］，但消融法具有較高的復發率，相關臨床研究較少。此外，腹腔鏡下卵巢囊腫剝除術中應用垂體后葉素能縮短手術時間，減少術中出血量，有利于保護卵巢功能［27］。

2.4 卵巢組織凍存胚胎凍存是臨床發展較成熟的一種有效保育手段，廣泛應用于體外受精治療［28］，可提供給已婚女性及愿意接受供精的育齡女性。在一項臨床研究中有33例乳腺癌患者接受了胚胎凍存并移植，平均移植時間5.25年，移植存活率45%［29］。有研究顯示移植前應用阿托西班可提高凍存胚胎移植的成功率［30］，應用GnRH 拮抗劑或激動劑可提高卵母細胞數量與累計活產率［31］。成熟卵母細胞凍存是應用更為廣泛的一種保育手段，可提供給未婚育齡女性及拒絕行胚胎凍存的患者。近年來，玻璃化冷凍方法通過使用高初始濃度的冷凍保護劑和超快速冷卻以盡量減少結晶，逐漸替代了慢冷凍方法，與慢冷凍技術相比，玻璃化冷凍技術使解凍后的卵母細胞存活率和妊娠率更高［32］。多項回顧性隊列研究發現玻璃化冷凍的卵母細胞與新鮮卵母細胞在植入成功率、持續妊娠率及活產率方面無明顯差異［33-34］，且與貯藏時間無關（5年以下）［35］，主要取決于患者年齡及卵子質量［36］。胚胎凍存和成熟卵母細胞凍存都需要卵巢刺激后再進行卵子質量檢測，而控制卵巢過度刺激的恢復過程約需2～3周，對于有些癌癥來說可能會耽誤病情。因此臨床醫師需要在排除卵巢組織有無癌癥細胞轉移的情況下，根據患者的年齡、卵巢儲備、卵泡刺激素水平、抗苗勒氏管激素水平等選擇合適的刺激方案和促性腺激素劑量。

卵巢組織凍存是通過手術獲得卵巢皮質組織凍存，然后將解凍后組織移植回盆腔（原位或異位）的一種保育手段，為青春期前需接受癌癥放化療患者提供了途徑。愛丁堡標準（Edinburgh criteria）建議卵巢組織凍存的患者年齡不超過35歲，若患者卵巢儲備功能良好，不超過38歲。原位移植是恢復生育功能及內分泌功能的首選方法［37］，移植部位大多在盆腔腹膜上，卵巢內部或者卵巢表面。待移植卵巢組織一般占整個卵巢組織的15%～25%。Demeestere等［38］在2015年報告了第1例青春期前接受化療患者卵巢組織凍存移植后的活產。關于卵巢組織移植的時間限制，國際上無統一指南，一般建議結束放化療治療3個月以上，并且無放化療合并癥（如腹水，惡病質等）。卵巢功能恢復多在移植后3.5～6.5個月。內分泌恢復率甚至高于排卵功能恢復率［39］，一般高于60%［40］，約2/3的卵巢組織在移植1年后仍有功能［40］。然而，進一步研究發現卵巢組織移植有造成腫瘤復發轉移及移植組織惡變的風險，尤其是血液系統腫瘤及卵巢癌等［41］。移植妊娠成功后立即再次取出凍存可降低復發風險［42］。卵母細胞體外成熟也可降低腫瘤復發風險，并且未成熟卵母細胞不需要通過卵巢刺激就可獲得，從而避免卵巢過度刺激綜合征等并發癥的出現，可與卵巢組織聯合凍存。相關活產報道較少，成熟率較低［43］。這一技術目前仍處于實驗階段，經濟效益與安全性尚未得到證實。人工卵巢提供了規避癌癥復發風險的另一解決方案。人工卵巢即從卵巢組織中分離卵泡及基質細胞，將之移植到人工纖維支架中，一項測試最適纖維蛋白基質濃度的實驗發現，F50/T50 組合在超微結構和剛性方面最類似于人卵巢皮質［44］，迄今為止仍處于動物實驗階段［45］。

3 結 語

針對腫瘤治療對年輕女性卵巢的損傷機制，現階段最常用且安全有效的做法是卵巢移位及卵巢組織凍存，研究方向最多的是干細胞移植、抑制細胞信號通路等藥物試驗、原始卵泡體外培養及人工卵巢等。保護女性腫瘤患者的卵巢功能任重而道遠，需要多學科廣泛合作，多途徑共同進行。