miR-200c及MALAT1在原發性不孕患者子宮內膜組織中的表達及臨床意義*

陸月梅 王秀美* 薛曉玲 周麗佳 儲巧香

原發性不孕是指未孕育過子女，且婚后有正常性生活女性在未避孕情況下1年未懷孕，原發性不孕發生影響因素有男性方面因素(如精液異常、免疫、性功能等)，也有女性方面因素(如輸卵管、子宮、陰道異常等)。由于近年來人們生活節奏加快、精神壓力增大、飲食習慣差、飲食結構不科學等，原發性不孕發病率在全球范圍內呈逐年上升趨勢[1]。對原發性不孕進展中相關因子研究，對患者病情及時評估和有效治療有重要價值。不孕癥發生發展與性激素水平變化密切相關，而microRNA-200c(miR-200c)在子宮內膜癌組織中高表達，能促進腫瘤細胞增殖和侵襲[2-3]。miR-200c在乳腺癌細胞中表達上調，與雌激素受體(estrogen receptor，ER)和細胞間充質轉化過程有關[4]。乳腺癌中肺癌轉移相關轉錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)表達水平明顯高于癌旁組織，MALAT1高表達與ER和孕激素受體(progesterone receptor，PR)水平有關[5]。前列腺癌中MALAT1能與ER、PR相互作用，共同促進腫瘤進展[6]。本研究旨在通過采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time-polymerase chain reaction，qRT-PCR)技術檢測原發性不孕癥患者子宮內膜組織中miR-200c和MALAT1水平，分析二者與性激素關系，探究二者在原發性不孕癥中的作用和意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年6月至2019年6月南通大學附屬海安醫院收治的86例原發性不孕患者，年齡23～36歲，平均年齡(26.37±6.24)歲，將其納入原發性不孕組，另選取同期行診斷性刮宮術的86名正常生育健康女性，年齡24～35歲，平均年齡(27.04±6.01)歲，作為健康對照組。兩組年齡比較無差異。本研究經醫院倫理委員會批準同意，所有入組者及家屬均對研究知情并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

(1)納入標準：①根據美國生殖醫學會對不孕女性診斷標準[7]確診為原發性不孕；②3個月內未用任何激素類藥物，無妊娠、哺乳和刮宮史；③子宮腔正常、輸卵管通暢。

(2)排除標準：①患有身體其他部位疾病；②精神異常；③丈夫精子、精液異常者。

1.3 儀器設備和試劑

采用7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；TR205-10型核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)提取試劑盒(北京天漠科技開發有限公司)；15750078反轉錄試劑盒(北京泰澤瑞達科技有限公司)；RR820A型熒光定量PCR試劑盒(日本TAKARA公司)；抗體622101-1 Anti-β-actin(上海恒斐生物科技有限公司)；MA515344 Anti-ER(天津泰澤興業生物科技有限公司)；MA515316 Anti-PR(天津泰澤興業生物科技有限公司)。

1.4 樣本采集

原發性不孕組患者于月經來潮24 h內，用內膜采集器獲取子宮內膜組織；健康對照組在行診斷性刮宮術時收集子宮內膜組織。所取材料一部分用于qRTPCR，另一部分用于western blot實驗。所有入組者在入組時清晨(7：00-9：00)空腹狀態下采集外周靜脈血5 ml，用于激素水平測定。

1.5 檢測方法

(1)qRT-PCR法檢測子宮內膜組織中miR-200c及MALAT1表達水平。采用Trizol法提取總RNA，反轉錄呈cDNA后-20 ℃保存，用于qRT-PCR實驗。①20 μl反應體系：Premix Ex TaqⅡ 10 μl，cDNA模板2 μl，上、下游引物各0.8 μl，ROX DyeⅡ0.4 μl，dH2O 6 μl；②反應步驟：95 ℃，30 s，1循環，95 ℃、5 s，63 ℃、33 s，40個循環，采用2-??CT法進行miR-200c及MALAT1相對表達量計算，所用引物見表1。

(2)Western blot法檢測子宮內膜組織中ER及PR蛋白表達水平。采用Western blot法檢測所有入組者子宮內膜組織中ER和PR表達水平，以β-actin蛋白為內參。用Quantity-One軟件收集ER、PR及β-actin條帶灰度值數據，二者與β-actin比值為各自相對表達水平。

表1 qRT-PCR引物

1.6 血清性激素水平測定

采用酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測入組者血清促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)、雌激素(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、睪酮(testosterone，T)以及催乳素(prolactin，PRL)水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.7 統計學方法

使用SPSS23.0統計軟件對研究數據進行分析，計量資料數據符合正態分布，采用均值±標準差()表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料用百分比(%)表示，采用x2檢驗。采用Pearson法分析miR-200c和MALAT1與E2、P、ER及PR相關性，采用Logistic回歸模型分析原發性不孕危險因素，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較

原發性不孕組患者的年齡、體質量指數(body mass index，BMI)與健康對照組相比，差異無統計學意義(t=0.380，t=0.433；P＞0.05)。原發性不孕組患者有避孕史、痛經比例和有家族史比例顯著高于健康對照組，差異有統計學意義(x2=15.740，x2=14.606，x2=5.287；P＜0.05)，見表2。

表2 兩組臨床資料比較[例(%)]

2.2 兩組激素水平比較

原發性不孕組患者血清中E2、FSH、LH、T、PRL及子宮內膜組織中ER水平顯著高于健康對照組，差異有統計學意義(t=7.159，t=8.007，t=7.739，t=7.471，t=8.867，t=15.264；P＜0.05)；血清P及子宮內膜組織中PR顯著低于健康對照組，差異有統計學意義(t=12.728，t=13.961；P＜0.05)，見表3。

表3 兩組激素水平比較()

表3 兩組激素水平比較()

注：表中E2為雌激素；P為孕酮；FSH為血清促卵泡激素；LH為黃體生成素；T為睪酮 ；PRL為催乳素；ER/β-actin為雌激素受體相對表達量；PR/β-actin為孕激素受體相對表達量

2.3 兩組子宮內膜組織中miR-200c和MALAT1表達水平比較

原發性不孕組患者子宮內膜組織中miR-200c和MALAT1表達水平與健康對照組相比均明顯升高，兩組相比差異有統計學意義(t=22.388，t=19.543；P＜0.05)，見表4。

表4 兩組子宮內膜組織中miR-200c和MALAT1表達水平比較

2.4 原發性不孕患者子宮內膜組織中miR-200c和MALAT1表達水平與血清激素水平相關性

原發性不孕患者子宮內膜組織中miR-200c和MALAT1表達水平與P水平無關，與E2、ER水平呈正相關(r=0.354，r=0.541，r=0.426，r=0.492；P＜0.05)，與PR水平呈負相關(r=-0.483，r=-0.395；P＜0.05)，見表5。

2.5 原發性不孕發生危險因素分析

以原發性不孕患者血清E2水平、子宮組織ER、PR、miR-200c及MALAT表達水平為自變量進行Logistic回歸分析可知，ER高水平、PR低水平、miR-200c高水平以及MALAT1高水平是原發性不孕發生危險因素(OR=2.678，OR=3.173，OR=3.282，OR=3.094；P＜0.05)，見表6。

表5 子宮內膜組織中miR-200c和MALAT1表達水平與血清各激素水平相關性

表6 原發性不孕發生危險因素Logistic回歸分析

3 討論

有研究表明，家族史、藥流史、受孕年齡等在一定程度上影響不孕癥的發生[8-9]。本研究結果顯示，原發性不孕組患者有避孕史、痛經比例和有家族史比例顯著高于健康對照組，提示有避孕史、痛經和家族史可能與原發性不孕發生有關。原發性不孕發病機制復雜多變，如陰道、子宮和卵巢先天性發育異常，陰道、子宮和輸卵管炎癥，以及輸卵管積液，宮頸狹窄及息肉等[10]。臨床中若不能及時診斷出病因及患病程度，患者會因無法進行有效治療而病情加重，對患者精神和生活質量造成危害。目前不孕癥相關因子已有少量研究，但探尋更多相關生物標志物對控制患者病情、制定有效治療方案有一定幫助。

Botelho等[11]研究證實，E2可作為感染引起的不孕癥的潛在生物標志物。Kobayashi[12]和Dorostghoal[13]等研究表明，E2和ER刺激子宮內膜細胞增殖，與子宮著床窗口關閉和子宮內膜容受性改變有關。P水平低與不孕有關，臨床多用P輔助生殖和治療不孕癥[14]。Petousis等[15]研究報道，不明原因不孕患者子宮內膜組織中PR表達下調，PR可能作為治療靶點以改善生殖結局。

本研究結果顯示，原發性不孕患者血清中E2、ER水平明顯高于健康對照組，P、PR水平明顯低于健康對照組，提示血清E2、ER水平升高，P、PR水平降低可能與原發性不孕癥發生有關，而E2、ER、P及PR可能通過調控子宮內膜容受性，影響受孕進展。

miRNA是一類能穩定存在于細胞和組織中的短鏈非編碼RNA，具有調控功能，能參與多種疾病調控。原發性不孕癥與子宮內膜異位癥密切相關，Dong等[16]研究發現，miR-191在子宮內膜異位癥患者血清中表達水平升高，與子宮內膜異位癥向惡性轉化有關。Zhang等[17]研究證實，與健康對照組相比，輸卵管炎異位妊娠患者體內miR-1247表達水平顯著升高，可能是異位妊娠生物標志物。本研究結果顯示，miR-200c在原發性不孕患者子宮內膜組織中表達水平顯著高于健康對照組，提示miR-200c可能與原發性不孕發生發展有關。Islam等[18]在子宮平滑肌瘤研究中發現，細胞外基質積累中miR-200c水平與ER、PR水平變化有關。Zheng等[19]研究報道，與健康非妊娠和早孕婦女相比，miR-200c在流產和不孕癥患者血清中表達水平升高，與子宮內膜容受性降低有關。本研究結果發現，原發性不孕患者子宮內膜組織中miR-200c表達水平與E2、ER水平呈正相關，與血清PR水平呈負相關，提示miR-200c可能通過調控E2、ER及PR水平，影響子宮內膜容受性，參與原發性不孕癥進展。具體作用機制還需深入研究。

MALAT1是一種與腫瘤增殖、分化和轉移有關的長鏈非編碼RNA。有研究報道，MALAT1在宮頸癌組織中相對表達量明顯高于癌旁組織，與腫瘤淋巴結轉移有關，可促進宮頸癌細胞增殖[20-21]。上皮性卵巢癌患者血漿中MALAT1表達水平顯著高于健康對照組，是患者發生腫瘤細胞低分化、淋巴結轉移危險因素[22]。不孕癥發生與子宮內膜增殖、著床窗口狀態和子宮容受性有關[13]。本研究結果顯示，與健康對照組相比，原發性不孕癥患者子宮內膜中MALAT1表達水平明顯升高，提示MALAT1高表達可能影響原發性不孕發生。有研究表明，MALAT1表達水平與E2、ER及PR水平有關[5-6]。本研究結果顯示，原發性不孕患者子宮內膜組織中MALAT1表達水平與E2、ER水平呈正相關，與血清PR水平呈負相關，但具體機制尚需進一步研究。MALAT1可能通過影響E2、ER及PR水平，促進子宮內膜增殖，抑制子宮內膜容受性，影響患者受孕進程[23]。本研究還發現，ER高水平、PR低水平、miR-200c高水平、MALAT1高水平是原發性不孕發生危險因素，提示ER、PR、miR-200c及MALAT1均可能作為原發性不孕生物標志物，用于評估疾病發生發展，為患者病情診斷和治療方案確定提供一定幫助。

4 結論

原發性不孕患者子宮內膜組織中miR-200c、MALAT1表達水平明顯高于健康對照組，與E2、ER和PR水平變化有關，可能通過影響E2、ER和PR水平參與原發性不孕發生發展。但由于本研究樣本量較少，方法較為基礎單一，具體作用機制還需進行大量實驗深入研究。