關(guān)于當(dāng)前微生物檢驗技術(shù)的分析

陳宏英

（河北省灤平縣衛(wèi)生健康局，河北 灤平 068252）

微生物主要包括原核微生物、真核微生物、病毒等三大類，由于多數(shù)微生物的個體較小，肉眼無法觀察，對其計數(shù)一般比較困難。在目前的微生物實驗教學(xué)中，對微生物計數(shù)的方法主要有三大類:總細(xì)胞計數(shù)法、活細(xì)胞計數(shù)法和微生物生長量測定法。并不是每一種方法都是通用的，不同的微生物種類需要不同的計數(shù)方法，目前多用以下8種方法進行計數(shù):

一、總細(xì)胞計數(shù)法

（一）血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)法

血細(xì)胞計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上劃有計數(shù)室，通過對計數(shù)室中的微生物數(shù)量的讀取，計算原溶液中的微生物數(shù)量。此方法由于計數(shù)板較厚，且計數(shù)室的高度是0.1～，不能采用油鏡進行觀察，故只能對體積較大的真核微生物進行測定，如酵母菌、霉菌抱子等，只能測得所有細(xì)胞的總數(shù)，不能區(qū)別死細(xì)胞和活細(xì)胞，尤其是對運動能力強的活細(xì)胞難以計數(shù)。目前已經(jīng)提出一些方法，如結(jié)合特定的美藍染色技術(shù)，區(qū)別酵母菌死活細(xì)胞;將運動的細(xì)胞加人甲醛溶液中，破壞其運動以便計數(shù)等。

（二）細(xì)菌計數(shù)板計數(shù)法

細(xì)菌計數(shù)板是在血細(xì)胞計數(shù)板的基礎(chǔ)上改進而來，主要是降低計數(shù)板的厚度，同時將計數(shù)室的高度從0.1～降低到0.02～，以用油鏡對較小的原核微生物進行計數(shù)。

（三）膜過濾計數(shù)法

利用計數(shù)板對高濃度的菌液測定比較準(zhǔn)確，但當(dāng)樣品中細(xì)菌的數(shù)量很低時，如湖水、海水或飲用水等，用膜過濾計數(shù)法更精確些，可以將一定體積樣品溶液加結(jié)晶紫染色，再用0.22卜m的聚偏二氟乙烯膜負(fù)壓過濾，再用無菌水沖洗至無色后，將過濾的膜進行抽干，將膜放到載玻片上，滴加甘油，蓋上蓋玻片，即可在顯微鏡下計數(shù)。一般隨機抽取20個視野進行計數(shù)，最后算平均數(shù)，計算整個濾膜上的菌的數(shù)量，得到原菌液中的微生物數(shù)量。此測定方法一般只能用于樣品中細(xì)菌數(shù)量很低的情況，多數(shù)時候細(xì)菌個體由于粘附成團而影響結(jié)果。所以，過濾前的細(xì)胞分散處理很重要，例如將細(xì)菌懸液經(jīng)過酸堿或超聲波處理，將聚團的細(xì)胞打散，可以增加此方法的準(zhǔn)確性。

二、活細(xì)胞計數(shù)法

（一）平板菌落計數(shù)法

平板菌落計數(shù)法只能用于測定活細(xì)胞的數(shù)量，但是操作過程相對計數(shù)板而言復(fù)雜一些，而且測得的細(xì)菌數(shù)量往往小于實際值。主要原因是在計算細(xì)菌濃度時，往往每個菌落并不一定是由一個單細(xì)胞生長繁殖而來，有可能是2個或多個，致使結(jié)果比實際菌液樣品中的細(xì)菌數(shù)量低，這也就是為什么現(xiàn)在都用菌落形成單位數(shù)(c何mL)來取代過去的絕對細(xì)菌數(shù)量。為了使菌落數(shù)更接近實際菌液中細(xì)菌的數(shù)量值，目前多數(shù)辦法是:盡量擴大稀釋倍數(shù)，涂布平板時少取稀釋菌液，使平板中的菌落數(shù)減少，避免由于菌液中細(xì)菌數(shù)過多造成多個細(xì)菌形成一個菌落。例如，將系列梯度稀釋至10一8或更低(稀釋倍數(shù)取決于原菌液)。

（二）比濁法

微生物細(xì)胞在一定濃度范圍內(nèi)，與濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大。故可通過分光光度計測定吸光值，通常測定600nm下的吸光值OD石(X)，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，求出樣品中菌液濃度，計算出細(xì)胞的數(shù)量。實驗測定時容易出現(xiàn)誤差，必須控制菌濃度在與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。

（三）霉菌計數(shù)法

對于霉菌的計數(shù)一般比較困難，由于霉菌生長快、菌絲疊加導(dǎo)致無法準(zhǔn)確計數(shù)。國標(biāo)霉菌計數(shù)法的原理是:將待測菌液進行10倍梯度系列稀釋，利用高鹽察氏培養(yǎng)基(CAO)與待測菌液混勻后倒平板，25℃一28(土1)℃下培養(yǎng)3d后開始計數(shù)，選擇菌落數(shù)在10一150之間的平板進行計數(shù)，取同稀釋度的兩個平板的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每g(或mL)檢樣中所含霉菌數(shù)。

三、微生物生長量測定法

（一）凱氏定氮計數(shù)法

蛋白質(zhì)是微生物細(xì)胞的主要成分，含量較穩(wěn)定，可以通過測定樣品中含量穩(wěn)定的蛋白質(zhì)的量計算細(xì)菌的數(shù)量，將細(xì)胞洗滌收集，用凱氏定氮法測全氮，蛋白質(zhì)含氮量為16%，細(xì)菌中蛋白質(zhì)含量因種類的不同而有差別，平均值為65%，根據(jù)每一種微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)總含量可以計算出待測樣品中細(xì)胞的總質(zhì)量，最后根據(jù)單個細(xì)胞的質(zhì)量計算出樣品的細(xì)胞數(shù)量。總含氮量與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系為:蛋白質(zhì)總量=含氮量/16%，那么，微生物細(xì)胞總質(zhì)量二蛋白質(zhì)總量/65%，微生物細(xì)胞總數(shù)=細(xì)胞總質(zhì)量/單個細(xì)胞質(zhì)量。每一種微生物細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量不同，且不同時期的細(xì)胞蛋白質(zhì)含量、單個細(xì)胞的質(zhì)量都有差別，所以用此方法測定的結(jié)果誤差較大，只能作為參考。

（二）DNA含量測定法

相比凱氏定氮計數(shù)法較大誤差，DNA含量測定法相對較準(zhǔn)確。每個微生物細(xì)胞的DNA含量非常恒定，平均為8.4xl0-5，將一定體積的細(xì)菌懸液離心，從細(xì)菌細(xì)胞中提取DNA，得其重量，則可計算出這一定體積的細(xì)菌懸液所含的細(xì)菌總數(shù)。

本文對常用的8種微生物數(shù)量測定方法進行總結(jié)與比較，血細(xì)胞計數(shù)板和細(xì)菌計數(shù)板常用于測定單細(xì)胞或胞子，相對比較準(zhǔn)確;膜過濾用于測定細(xì)胞濃度很低的樣品，平板菌落計數(shù)對多數(shù)微生物的測定都適用，但是相對其他計數(shù)法要復(fù)雜;比濁法相對準(zhǔn)確，但需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線;對于絲狀微生物的數(shù)量測定，國際上有明確的標(biāo)準(zhǔn);而凱氏定氮法和DNA含量測定法都是通過對微生物細(xì)胞內(nèi)含量相對穩(wěn)定的物質(zhì)進行定量測定，再算出細(xì)胞的數(shù)量，操作相對復(fù)雜。