人牙髓干細胞向成牙本質細胞分化中circRNAs差異表達的研究

肖婷婷 林詩晗 柯志紅 邱在玲 曾建釵 胡雪剛 林雪梅 鄒璐寧 呂紅兵

人牙髓干細胞(dental pulp stem cells，DPSCs)的主要功能是分化為成牙本質細胞，并通過與上皮干細胞的相互作用參與牙釉質的形成[1-2]，因此DPSCs在牙釉質、牙本質和牙髓組織再生中具有重要作用。

環狀RNA(circRNA)是一種含有環狀結構[3]的內源性非編碼RNA。1976年，首次在病毒中發現circRNAs，與線性RNA相比，該環狀結構更穩定，對RNase R的抵抗性更強[4]。有研究發現，在哺乳動物內發現了大量的circRNAs，因其為環狀，不易被降解，故circRNAs可作為疾病診斷的生物標志物[5]。

研究表明，circRNAs參與成骨分化的過程。Qian等[6]研究發現，circ19142和circ5846在小鼠MC3T3-E1成骨細胞成骨分化中具有重要作用。此外，Zheng等[7]發現，差異性的circRNAs在牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)成骨分化和生物礦化過程中具有重要作用。而DPSCs作為牙髓再生重要的種子細胞，其成牙本質分化是否受到circRNAs的調控，目前尚未見報道。本研究旨在闡明circRNAs在DPSCs成牙本質分化中的作用，為進一步探索circRNAs在DPSCs成牙本質分化中的調控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

胎牛血清(FBS，Hyclone，USA)；10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/ml維生素C、10 mol/L地塞米松、Ⅰ型膠原酶、dispase Ⅱ酶(Sigma，USA)；鼠抗人STRO-1單克隆抗體(R&D systems，USA)；ALP檢測試劑盒、茜素紅(上海碧云天生物技術研究所)；芯片(Arraystar，USA)。

1.2 牙髓細胞的培養

選取臨床17～23 歲健康的第三磨牙或因正畸需要拔除的牙，在超凈臺里取出牙髓，CD酶(3 mg/ml I型膠原酶，4 mg/ml dispase Ⅱ酶)消化、終止、離心、重懸后過細胞篩，得到單細胞懸液。加入含10% FBS的α-MEM培養液，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，24 h后換液，10 d后更換半液，14 d后更換全液，標記為原代。細胞生長的密度至80%～85%時，用胰酶消化傳代，標為第1代，取第2～3代細胞進行實驗。

1.3 免疫磁珠分選DPSCs

取1×107對數生長期的牙髓細胞，用鼠抗人STRO-1單克隆抗體50 μg /107cells 標記；每107個細胞加入80 μl buffer、20 μl免疫磁珠，混勻后于4 ℃冰箱避光孵育15 min；陽性細胞留在磁柱里；取下LS柱，加入5 ml buffer快速推下，收集到的細胞即為DPSCs。采用CCK-8法檢測細胞增殖情況，酶標儀檢測A值(450 nm)，取均值描繪生長曲線，實驗重復3 次。

1.4 DPSCs的礦化能力鑒定

當第2代的DPSCs密度達80%～85%時，以每孔2×103個細胞接種于6 孔板。細胞匯合達70%后，實驗隨機分為2 組，對照組繼續采用普通培養基培養，實驗組改用成牙本質誘導液(含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/ml維生素C、10 mol/L地塞米松、10% FBS的α-MEM培養液)，培養21 d。取第7天培養的2 組細胞，采用ALP檢測試劑盒進行ALP活力測定；取第14天培養的兩組細胞，進行ALP染色(1%多聚甲醛于室溫下固定30 min，加入現配的ALP混合液黑暗處染色30 min，三蒸水快速沖洗，于顯微鏡下拍照)；取第21天培養的2 組細胞，進行茜素紅染色(1%多聚甲醛于室溫下固定30 min，加入1%茜素紅染色10 min，三蒸水快速沖洗，于顯微鏡下觀察)，通過觀察礦化結節來鑒定其礦化能力。

1.5 Arraystar芯片檢測circRNAs表達譜

取第3代DPSCs按以上分組進行實驗，取14 d培養后的兩組細胞，加入Trizol靜置5 min后提取總RNA。使用Arraystar芯片，樣品標記和陣列雜交按照廠家的標準流程進行操作。將原始數據掃描圖導入Agilent提取軟件中進行原始數據提取。

1.6 circRNAs靶基因預測及生物信息學分析

對于差異表達的circRNAs，結合miRanda和TargetScan軟件搜索其靶基因。使用DAVID6.7功能注釋工具對差異circRNAs的靶基因進行GO和KEGG功能富集分析。利用DAVID將GO注釋分成細胞組成、分子功能和生物過程3 個類別。GO和KEGG使用的統計學方法是基于超幾何分布的Fisher精確檢驗，P<0.05時，具有統計學意義。

2 結 果

2.1 DPSCs的分離及礦化能力鑒定

細胞懸液通過CD酶消化獲得，原代細胞培養24 h后開始貼壁生長，細胞呈星形或梭形。約3～4 d后細胞密度可達80%～85%。免疫磁珠篩選出STRO-1+的DPSCs，DPSCs的形態為纖維樣，胞漿突起呈長梭形(圖 1)。繪制DPSCs生長曲線，可見DPSCs的生長曲線呈S型(圖 2)。

圖 1 原代培養的細胞和DPSCs(P3)的形態(倒置顯微鏡， ×100)

圖 2 DPSCs的生長曲線

DPSCs常規培養7 d的ALP活力測定值別為1.38±0.09；成牙本質誘導7 d后的DPSCs，ALP測定值為8.74±0.85，差異具有統計學差異(P<0.05)，表明經礦化誘導后的DPSCs具有成牙本質細胞的特性。此外，DPSCs誘導14 d后，用ALP試劑盒染色，細胞局部增厚，染色明顯加深。誘導21 d后，用茜素紅染色，可見散在橙紅色礦化結節(圖 3)。

圖 3 DPSCs誘導分化后ALP和茜素紅染色結果(倒置顯微鏡， ×40)

2.2 DPSCs成牙本質誘導分化中circRNAs表達譜差異分析

運用R語言的limma對所有表達的circRNAs進行標準化，在每組數據中選取|差異倍數|>2的circRNAs。與對照組相比，DPSCs誘導后有42 個基因上調，有101 個下調。散點圖顯示：DPSCs在成牙本質誘導分化中circRNAs的表達情況，綠線表示差異2 倍的變化線，在軸線上方表示差異倍數>2的circRNAs，軸線下方表示差異倍數<-2的circRNAs(圖 4)。

圖 4 DPSCs成牙本質細胞誘導后circRNAs的差異表達

2.3 差異表達circRNAs靶基因的功能分析

對差異表達circRNAs的靶基因進行預測，并對其進行GO分類和KEGG pathway分析。對GO結果(P<0.05)分析可得出：靶基因主要存在于胞漿、核質等細胞內；可以定位大分子的位置，調節分子載體、核質載體等分子的活性；影響核質運輸，核轉運，膽固醇代謝等生物學過程。KEGG分析結果(P<0.05)表明：對差異表達的circRNAs預測的靶基因進行Pathway注釋，其中主要涉及泛素介導的蛋白質水解、病毒、細菌感染途徑、癌癥途徑、甾體生物合成等途徑，也調控Wnt、PI3K-Akt和MAPK等多種信號通路。

3 討 論

目前，對患有慢性根尖周病的年輕恒牙，一種理想的治療方式是采用牙髓血運重建術，應用健康的牙髓組織代替壞死的牙髓組織，以促進牙根的繼續發育，甚至牙髓再次出現活力[8]。DPSCs參與牙髓牙本質復合體的形成，使牙髓修復和再生成為可能[9]。前期課題組研究[10]發現，DPSCs具有較高的增殖率和礦化潛能，且DPSCs來源廣，在成年后DPSCs仍較易獲得。研究表明，DPSCs的生物學特性可以通過改變來促進牙髓血管再生，Khayat等[11]將含有臍靜脈內皮細胞的凝膠加入DPSCs中，發現組織再生能力增強；Chen等[12]將富血小板纖維蛋白加入DPSCs中，發現其成骨能力增強。

circRNAs是一類獨特的RNA，由特殊的環剪接形成的穩定結構[4]，因此，circRNAs不易受RNase R的降解，由于其豐富、穩定和細胞型特異性表達[5]，已成為基因調控和細胞內穩態的重要因素，不僅在細胞生長過程中起重要的作用，還在疾病的發病機制中作為有效的miRNAs海綿起著關鍵的作用[6,13]。有研究表明，circRNAs可作為許多疾病診斷的理想生物標志物，如動脈粥樣硬化性血管性疾病、神經紊亂、朊蛋白疾病、癌癥和阿爾茨海默氏病[13-14]。

目前已有大量的研究證實了circRNAs在牙源性干細胞向成骨分化中發揮了重要調控作用，且較為深入。Gu等[15]發現，PDLSCs向成骨分化時，有766個差異性circRNAs上調，690個circRNAs下調，這些差異表達的circRNAs的靶基因通過Wnt和MAPK信號通路促進PDLSCs成骨分化。Li等[16]發現，Circular RNA CDR1as通過miR-7/GDF5/SMAD和p38 MAPK信號通路調節PDLSCs的成骨分化，CDR1as或GDF 5的下調可抑制SMAD1/5/8和p38 MAPK的磷酸化，而上調miR-7則可降低SMAD 1/5/8和p38 MAPK的磷酸化。過表達的CircRNA CDR1as通過競爭性的結合miR-7，上調GDF5來促進PDLSCs的成骨分化。Du等[17]研究表明，在大鼠牙囊細胞(rat dental follicle cells rDFCs)成骨分化過程中，過表達的circFgfr2，通過競爭性結合miR-133，激活MAPK和TFG-β信號通路，靶向上調BMP6來促進rDFCs成骨。但circRNAs在DPSCs向成牙本質分化中的研究尚少，它是如何影響DPSCs干性狀態的，目前尚未見報道。

本研究采用磁珠分選技術分選出hDPSCs，并通過Arraystar芯片檢測DPSCs在成牙本質向誘導分化過程中特異性表達的circRNAs，并探討其在DPSCs向成牙本質分化中的作用。與常規培養的DPSCs相比，circRNAs在成牙本質誘導分化中存在明顯差異。|差異倍數|>2的circRNAs有143 個，其中，有42 個circRNAs在成牙本質誘導分化中高表達，提示差異性circRNAs可能在hDPSCs向成牙本質誘導分化中發揮重要作用。

本實驗研究結果表明，差異性的circRNAs主要參與泛素介導的蛋白質水解、病毒、細菌感染途徑、癌癥途徑、甾體生物合成等途徑，也調控Wnt、PI3K-Akt和MAPK等多種信號通路。有研究表明，Wnt[10,15]和MAPK[15-17]通路在骨骼發育，甚至在PDLSCs的成骨分化中至關重要。研究發現，這些差異表達的circRNAs在其他領域中也有相關的研究，如Zhu等[18]研究發現，hsa_circ_0081001在骨肉瘤(osteosarcoma，OS)細胞系、組織和血清中顯著上調，表明hsa_circ_0081001可以作為OS患者診斷的標志物和治療靶點。Lv等[19]研究發現：在髓母細胞瘤(medulloblastoma，MB)中，上調的circ-SKA3(hsa_circ_0029696)和circ-DTL(hsa_circ_0000179)通過調節宿主基因SKA3和DTL的表達來促進髓母細胞體外增殖和侵襲，促進MB發生和發展，可認為是診斷MB潛在的生物標志物及治療的新靶點。這與本研究中circRNAs調控癌癥途徑相符。在DPSCs向成牙本質分化過程中，差異表達的circRNAs有可能激活Wnt、PI3K-Akt和MAPK通路或其他信號通路，調控細胞分化，使DPSCs獲得更強的分化能力，但這種推論有待進一步證實。