為什么新型冠狀病毒的檢出率不能達(dá)到100%

王煦

自2020年年初新型冠狀病毒導(dǎo)致的肺炎在國(guó)內(nèi)暴發(fā)以來，感染人數(shù)不斷上升。2020年3月11日，世界衛(wèi)生組織總干事譚德塞在日內(nèi)瓦記者會(huì)上宣布，此次由新型冠狀病毒導(dǎo)致的疫情具有大流行病的特征[1]。 截至2020年3月16日，各國(guó)累計(jì)確診病例中，排名前四的國(guó)家為：中國(guó)81062例，意大利21270例，伊朗13938例，韓國(guó)8162例[2]。目前，我國(guó)感染新型冠狀病毒的人數(shù)新增量在不斷減少，但是對(duì)于其他國(guó)家來說，形勢(shì)依然十分嚴(yán)峻。

3月4日，國(guó)家衛(wèi)健委印發(fā)新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）[3]，此診療方案中提到，疑似病例的確診標(biāo)準(zhǔn)之一為實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng)）檢測(cè)新型冠狀病毒核酸陽性。但是，這個(gè)被稱為“金標(biāo)準(zhǔn)”的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)在臨床應(yīng)用中卻被報(bào)道存在假陰性，即被檢測(cè)者已經(jīng)感染了新型冠狀病毒，但是檢測(cè)不出病毒核酸。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，很多沒有醫(yī)學(xué)、生物背景的朋友初次聽到這個(gè)名字也許會(huì)十分疑惑，什么是核酸？什么是實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR？為什么被稱為“金標(biāo)準(zhǔn)”的RT-PCR檢測(cè)技術(shù)在臨床實(shí)踐過程中并不能100%檢測(cè)出新型冠狀病毒？下面為大家一一解答。

什么是核酸

核酸，簡(jiǎn)單來講就是遺傳物質(zhì)，一種能夠傳遞遺傳信息的物質(zhì)，通常由親代傳給子代，能夠控制子代的生長(zhǎng)發(fā)育。一般來說，不同的生物所攜帶的遺傳信息都是獨(dú)特的（同卵雙胞胎除外）。遺傳物質(zhì)分為DNA（脫氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸），大多數(shù)病毒的遺傳物質(zhì)都為RNA。以新型冠狀病毒為例，此病毒的核酸就是RNA，其RNA由四種不同核糖核苷酸排列組成，因?yàn)榕帕械捻樞蛞约八煌N類核糖核苷酸的數(shù)量不同，使得新型冠狀病毒的RNA與其他RNA病毒的RNA有所不同。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)就是利用新型冠狀病毒所具有的獨(dú)特RNA，對(duì)其進(jìn)行特異性檢測(cè)。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)原理

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR是將實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和RT-PCR技術(shù)相結(jié)合[4]，首先，采用RT-PCR技術(shù)，使新型冠狀病毒的RNA逆轉(zhuǎn)錄DNA;然后，用DNA作為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增[5];同時(shí)，使用探針（目前的試劑盒主要使用的是Taq Man探針1）與對(duì)應(yīng)的核酸片段進(jìn)行結(jié)合，結(jié)合在核酸片段上的探針在特殊的外切酶活性作用下發(fā)生水解，產(chǎn)生熒光。隨著DNA片段的不斷擴(kuò)增，熒光信號(hào)不斷增強(qiáng)，DNA的數(shù)量以熒光信號(hào)的形式間接地被相關(guān)儀器記錄。最后，根據(jù)熒光信號(hào)與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系可以繪制出實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，從而檢測(cè)出標(biāo)本中是否含有新型冠狀病毒核酸[6-7]。

通俗來講，新型冠狀病毒與實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的關(guān)系就是，新型冠狀病毒的RNA可以看成它的身份證，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中的引物并不能直接識(shí)別這種身份證上的信息，所以當(dāng)我們從患者標(biāo)本中獲取到RNA時(shí)，首先需要采用RT-PCR對(duì)身份證的信息進(jìn)行翻譯轉(zhuǎn)換，將病毒的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，使其病毒信息能夠被實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物和探針識(shí)別。但是，我們從原始標(biāo)本獲得的RNA太少，低于了儀器檢測(cè)的下限，所以，我們首先要對(duì)獲得的信息進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增，在擴(kuò)增的同時(shí)將這些信息打上標(biāo)簽（探針），而被打上的標(biāo)簽在一定作用下（特定酶水解作用）可以發(fā)出熒光，被儀器檢測(cè)到，這樣就可以通過檢測(cè)病毒核酸的存在來間接證實(shí)病毒的存在。

“金標(biāo)準(zhǔn)”為何“失效”

根據(jù)上述原理可知，新型冠狀病毒的核酸檢測(cè)與很多因素相關(guān)。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)而得到假陰性結(jié)果（即已經(jīng)是感染者，但檢測(cè)不出病毒核酸）的原因主要有兩點(diǎn)[8]。

第一個(gè)原因是原始標(biāo)本中的RNA含量太低，低于了實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)下限，使得病毒核酸無法得到有效擴(kuò)增，從而無法產(chǎn)生足夠的熒光信號(hào)而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果為陰性。

這與標(biāo)本的取材、患者感染的時(shí)間以及取到標(biāo)本后檢測(cè)的時(shí)間都有關(guān)系。受病毒感染機(jī)制影響，不同組織來源的標(biāo)本病毒核酸含量差異較大。研究顯示，新型冠狀病毒更趨向于結(jié)合肺泡上皮細(xì)胞，因此，理論上來說，感染者下呼吸道標(biāo)本病毒核酸檢測(cè)準(zhǔn)確率會(huì)比上呼吸道標(biāo)本的更高。患者感染的時(shí)間也是一個(gè)重要因素。病毒在侵入人體細(xì)胞之后需要時(shí)間去繁殖，如果是早期患者的標(biāo)本，病毒剛剛?cè)肭旨?xì)胞，沒有足夠的時(shí)間復(fù)制，細(xì)胞中也就沒有那么多病毒核酸。此外，這次感染的人數(shù)眾多，人力、物力都十分有限，很多患者標(biāo)本在取到后都來不及及時(shí)檢測(cè)，在等待檢測(cè)的時(shí)間里，病毒RNA會(huì)有一定程度的分解，這也導(dǎo)致了原始病毒的核酸過低。

第二個(gè)原因是在原理中提到的探針結(jié)合，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中，探針能夠特異性結(jié)合到病毒核酸片段上，在酶的參與作用下發(fā)出熒光信號(hào)，從而間接反映病毒核酸的存在。但是，如果探針結(jié)合的病毒核酸部位發(fā)生變異，可能會(huì)影響探針的結(jié)合效率，導(dǎo)致熒光信號(hào)檢測(cè)不到，而出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。

此外，假陰性的發(fā)生也跟此技術(shù)本身的靈敏度有關(guān)，此次新型冠狀病毒肺炎暴發(fā)得太突然，目前，應(yīng)用于臨床的試劑盒并不成熟，靈敏度還不夠。

多方面改善假陰性問題

針對(duì)上述假陰性問題，國(guó)家正從各方面努力進(jìn)行改善。比如，標(biāo)本質(zhì)量不好，國(guó)家衛(wèi)健委公布的第六版新型冠狀病毒肺炎診療方案[9]指出需要全面規(guī)范采樣，在這之后，公開報(bào)道的假陰性患者數(shù)量明顯減少;比如，試劑盒不夠靈敏，國(guó)內(nèi)各個(gè)醫(yī)院、研究機(jī)構(gòu)正在不斷努力，已經(jīng)研發(fā)出了一些新的核酸檢測(cè)試劑盒。四川大學(xué)華西醫(yī)院成功研發(fā)出了多款新型冠狀病毒檢測(cè)試劑盒，有兩項(xiàng)已經(jīng)進(jìn)入臨床驗(yàn)證階段。2020年3月，新型冠狀病毒引起的肺炎在中國(guó)已經(jīng)初步得到了控制，相信在不久的將來，一切都會(huì)恢復(fù)正常。

參考文獻(xiàn)

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[2] 百度新型冠狀病毒肺炎疫情實(shí)時(shí)大數(shù)據(jù)報(bào)告[EB/OL].（2020-03-15）[2020-03-15].https：//voice.baidu.com/act/newpneumonia/ newpneumonia/？from=osari_pc_3#tab4.

[3] 新浪新聞.國(guó)家衛(wèi)健委印發(fā)新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）[EB/OL]. （2020-03-04）[2020-03-15]. http：//news.sina.com.cn/o/2020-03-04/doc-iimxyqvz7707317.shtml.

[4] 許金和，王水良，張勝行，賴國(guó)祥，蘭小鵬，吳小麗，余宗陽.新型冠狀病毒核酸檢測(cè)方法[J/OL].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志：1-19[2020-03-16]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1176.R.20200303.1428.002.html.

[5] 魏徵霄，李青峰.新型冠狀病毒感染的臨床表現(xiàn)及其實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展～（*）[J/OL].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志：1-7[2020-03-17]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1176.r.20200228.1112.002.html.

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[7] 郭曉波，藺京，來春艷，張養(yǎng)民，龔衛(wèi)鋒，史敏，楊瑞利.新型冠狀病毒與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR核酸檢測(cè)[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2020，49（03）：264-266.

[8] 高維寅，張洪，羅陽.新型冠狀病毒肺炎核酸檢測(cè)中的假陰性分析及對(duì)策～（*）[J/OL].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志：1-8[2020-03-17]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1176.R.20200304.1030.004.html.

[9] 新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）[J/OL].天津中醫(yī)藥：1-5[2020-03-17]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/12.1349.R.20200304.1638.006.html.