植酸酶及其應用前景(綜述)(續2)

張相鑫譯 唐彩琰校

摘 ?要：植物和微生物產生的植酸酶可水解難溶性植酸并釋放磷酸鹽，從而使動物更容易獲得機體所需的磷。本文介紹了新型植酸酶的獲得方法，及其工業應用，為植酸酶在家禽生產中的應用提供思路。

關鍵詞：植酸;植酸酶;肌醇磷酸鹽

中圖分類號：S816 文獻標志碼：C 文章編號：1001-0769（2020）10-0073-04

4 ?獲得高科技的新型植酸酶

開發新型高效植酸酶制劑的主要要求與它們的活性有關，包括較寬的有效pH范圍、熱穩定和耐蛋白酶水解等。因此，有人認為應從能在極端條件下生存的生物中尋找新的植酸酶生產者，或基因修飾先前研究過的能夠生產植酸酶的生物，以便改善植酸酶的特性。在研究了生長在火山、溫泉和沙漠地區的微生物所生產的植酸酶后，研究人員發現了新的熱穩定性植酸酶。芽孢桿菌ZJ0702株和醫學環狀桿菌分泌的植酸酶熱穩定性最高，這些酶可在90 ℃～100 ℃的環境中保持活性。從喜馬拉雅地區土壤中分離到的草酸青霉菌（Penicillium oxalicum）EUFR-3株生產的植酸酶具有較高的活性，可在較寬的pH（pH3～8）范圍下保持穩定，并在pH為7.0和溫度為40 ℃時表現出最大的活性。這些特性使草酸青霉菌EUFR-3株生產的植酸酶在食品工業中有廣泛的應用前景。

利用宏基因組測序技術分析從不同生態系統中分離到的植酸酶的序列以及它們在大腸桿菌中的表達情況，使獲得具有不同最適pH范圍的熱穩定性植酸酶成為可能。這些植酸酶有望在動物生產中得到應用。

黑曲霉菌和煙曲霉菌生產的PhyA植酸酶最早得到廣泛研究，是可用于動物生產的植酸酶之一。通過位點特異性誘變替代某些氨基酸，研究人員改善了植酸酶的熱穩定性和最佳pH。這些研究還揭示了會影響植酸酶特性的最重要位點。P257氨基酸殘基位于連接芽孢桿菌合成蛋白的兩個 β-層的環上，其會影響這種生理活動的可塑性和該植酸酶的熱穩定性。這種效應與其他氫鍵的形成以及該環表面的P257氨基酸殘基有關。利用位點特異性誘變在分離自槌狀顆粒菌的植酸酶的催化中心附近增加4個新的二硫鍵，可提高該植酸酶的熱穩定性，且不會影響酶的活性。

研究人員在黑曲霉菌中表達了煙曲霉菌的PhyA基因，從而獲得了第一個重組植酸酶。該重組植酸酶具有較高的熱穩定性，且可在較寬的pH范圍內保持活性。長期以來，人們一直用大腸桿菌培養物獲得包括植酸酶在內的重組蛋白。胞外蛋白質的表達可以防止蛋白質在細胞內聚集，免受宿主蛋白酶的水解，從而提高蛋白質的產量。研究人員利用大腸桿菌培養物獲得了芽孢桿菌MD2株的胞外熱穩定性植酸酶，表明培養條件會顯著影響植酸酶的產量。在氯化鈣存在的條件下，重組植酸酶的活性顯著提高。研究表明，地衣芽孢桿菌PB-13株的植酸酶基因在大腸桿菌BL21株中表達后獲得的重組植酸酶rPhyB13 BBP在pH為4～8和溫度為80 ℃的環境中仍有活性，且可抵抗胰蛋白酶的水解。

試驗表明，選擇的宿主會影響重組酶的產量和特性。例如，研究表明，如果將真菌細胞用作重組植酸酶的生產者，可以提高蛋白質的糖基化水平。大腸桿菌appA植酸酶基因在巴斯德畢赤酵母菌中表達后可生產大量的重組蛋白，而通過替代對應的核苷酸進行N-糖基化位點靶向修飾獲得不同糖基化水平的AppA植酸酶。在蛋白質糖基化水平較高的三個突變體中，只有一個突變體被證明具有較高的熱穩定性和植酸親和力。此外，對由該突變體合成的植酸酶晶體結構進行研究后發現，該植酸的催化活性和熱穩定性與該蛋白α-結構域的可塑性變化有關。

枯草芽孢桿菌植酸酶基因在巴斯德畢赤酵母菌中的表達會提高所產生的蛋白質的糖基化水平和熱穩定性，而該植酸酶最適宜的pH范圍和溫度沒有改變。組氨酸酸性磷酸酶（Histidine Acidic Phosphatase，HAP）糖基化會提高酶在酸性條件下的穩定性，并可保護蛋白質免受胃蛋白酶的水解。為了獲得志賀氏菌CD2株的重組植酸酶，研究人員用巴斯德畢赤酵母代替大腸桿菌使得酶的熱穩定性提高。嗜熱側孢霉菌的植酸酶基因在巴斯德畢赤酵母菌中的表達可明顯提高目標產物的產量。在巴斯德畢赤酵母菌甘油醛-3-磷酸（Glyceraldehyde-3-Phosphate，GAP）脫氫酶的組成型啟動子中導入一個密碼子，可使重組嗜熱側孢霉菌胞外rStPhy植酸酶的產量提高40倍以上。GAP的使用使研究人員能夠消除甲醇誘導的弊端。

提高植酸酶效率的另一種方法是將該酶固定在殼聚糖、修飾型ZnO或Fe3O4的納米顆粒表面。應用這種方法可提高植酸酶的熱穩定性和pH穩定性，也可對金屬離子產生抗性。將大腸桿菌的植酸酶吸附在發酵芽孢桿菌孢子表面，也可提高植酸酶的熱穩定性。

5 ?植酸酶的工業應用

工業化生產的植酸酶被廣泛用于家禽、豬和水產動物的養殖。在飼料中添加植酸酶可提高動物對磷和蛋白質的吸收率，促進動物的能量代謝，同時可減少動物對磷酸鹽添加劑的需求量，從而可改善生態條件。

人類自1991年起開始對植酸酶進行工業化生產，當時德國巴斯夫（BASF）公司研發出利用黑曲霉菌生產植酸酶的方法。目前，植酸酶制劑主要由數十家公司生產，除巴斯夫公司外，還有美國的杜邦公司和諾偉思國際公司、丹麥的丹尼斯克動物營養公司和諾維信公司、英國的英聯食品公司、保加利亞的浩衛制藥公司以及印度的高端酶技術公司等。

已進行商品化推廣應用的植酸酶制劑主要是3-植酸酶和6-植酸酶。3-植酸酶來源于真菌（曲霉屬和青霉屬等），6-植酸酶來源于細菌[大腸桿菌（E. coli）和布氏檸檬酸桿菌等]。用于畜禽生產的商用 ?6-植酸酶制劑于2003年上市，研究證明該植酸酶具有更強的水解植酸的能力。這些植酸酶的優點是它們在動物胃腸道的酸性和堿性環境中都具有活性、熱穩定性和對蛋白酶的抗性。

與真菌源性植酸酶相比，使用細菌源性植酸酶可以提高動物的生產力，并使動物產品的主要生產成本降低20%。丹麥丹尼斯克公司的Fayzym植酸酶、保加利亞浩衛制藥公司的Khostazym植酸酶和荷蘭帝斯曼公司的Rhonozym植酸酶等植酸酶產品都是6-植酸酶。2013年，美國市場上出現了以布丘菌屬（腸桿菌科）的細菌為代表生產的植酸酶。這些植酸酶制劑在pH較低的環境中仍有活性。植酸酶制劑對飼料中植酸的水解效果和所需劑量取決于飼料的組成和植酸酶制劑的生產工藝。飼料含高水平的鈣可能會顯著降低植酸酶對植酸的水解效果。

植酸酶在美國和西歐各國已得到廣泛的應用，這些國家的應用方法被認為是植酸酶的行業標準。近年來，植酸酶在中國、印度和東南亞地區被越來越多地用作飼料添加劑。在俄羅斯，植酸酶制劑的使用還不是特別普遍。然而，畜禽養殖業的發展、經濟上的可行性以及生態保護力度的加強都刺激著植酸酶的推廣應用。在俄羅斯，只有69種含植酸酶的飼料添加劑被批準用于動物生產。這些飼料添加劑主要由歐洲制造商提供，如德國巴斯夫公司推出的11種商標名為Natufos的植酸酶產品，丹麥諾維信公司上市的6種商標名為Rhonozym的植酸酶產品，保加利亞標偉特公司提供的10種商標名分別為Kormofit、Khostazym和Optyfos的植酸酶產品。美國、中國和印度分別向俄羅斯推出了2種、10種和 ?10種植酸酶產品。

Natufos植酸酶制劑含有來自黑曲霉菌的未經基因修飾的植酸酶。Rhonozym HaiFos植酸酶制劑是丹麥諾維信公司利用布氏檸檬酸桿菌生產的，天然活性為 ? ?10 000 U/g，能承受95 ℃的高溫。武漢新華揚生物有限公司利用細菌植酸酶生產了成本低的植酸酶制劑Sunfize，該酶制劑已被俄羅斯多家家禽養殖場如Sverdlovskaya雞場和Ravis Sosnovskaya雞場（斯維爾德洛夫斯克地區）使用。

目前，俄羅斯Agroferment公司生產的Agrofit植酸酶正被用作飼料添加劑加入家禽、豬和魚的飼料中。該植酸酶由沒有經過基因修飾的灰青霉菌PhPl-33 BKM F-3867 D株生產。研究表明，Agrofit植酸酶在pH 2.5～7.0范圍內有活性，其被制成干燥的顆粒狀制劑后，在90 ℃下加熱5 min仍有活性。Agrofit植酸酶的活性為5 000 U/g，與其他國家同類產品的活性相當。Agroferment公司還生產Agroxyl酶制劑和Agrocell酶制劑，這些酶制劑除含有植酸酶外，還含有其他酶，如β-葡聚糖酶、蛋白酶、木聚糖酶和纖維素酶等。

飼料去植酸化也可以通過在飼料中添加產植酸酶的非致病性菌株來實現。農業廢棄物和工業廢料經微生物發酵后植酸的含量會減少，無機磷酸鹽的濃度會提高，從而可以提高它們在動物營養中的價值。研究發現，從芝麻根際部分離到的克氏檸檬酸桿菌PM-7株能有效水解小麥幼苗、麥麩、米麩、甘蔗渣、棉籽殼、芝麻粉、芥末粉以及椰肉中的植酸。將用小麥粉、芝麻粉餅和豆奶培養的嗜熱鏈球菌TLR50株用于家禽養殖，可提高飼料的無機磷酸鹽、蛋白質和糖的含量，降低植酸的濃度。

通過培育出能夠在唾液腺中表達大腸桿菌植酸酶基因（appA基因）的轉基因動物，可實現提高植物植酸中磷的吸收率的目的。對小鼠和豬的試驗表明，激活轉基因動物唾液中的植酸酶，可促進動物對飼料中植酸的吸收，減少動物的磷排放量。另一種可以向動物提供磷酸鹽的方法是利用微生物的植酸酶基因獲得轉基因植物。高活性植酸酶可幫助轉基因植物吸收積累在土壤中的植酸。此外，飼用谷物中的高活性植酸酶可導致谷物中的植酸儲備量減少。將這些植物用作動物飼料的原料，可促進動物對飼料中植酸磷的吸收。

利用真菌和細菌的植酸酶基因可培育出轉基因植物。表達PhyA基因或appA基因的歐洲油菜可在只有植酸鹽作為唯一磷源的條件下生長，能夠提供較高的生物產量，同時還會提高種子中植酸酶的活性，降低植酸的濃度。為了找出含有高活性植酸酶的植物，研究人員還對煙草、大豆、小麥、甘薯和油菜進行了試驗。結果表明，這些轉基因植物在生長期間以植酸鹽為磷源，能將胞外植酸酶分泌到植物的根際部。轉基因植物根際部釋放出的胞外植酸酶會提高可供植物利用的磷的水平，也為鄰近的植物創造了有利的生長條件。值得注意的是，植物在實驗室無菌土壤中表達植酸酶基因所產生的影響要比其在自然環境的更顯著。這顯然是植酸酶被排放到環境后迅速喪失活性造成的。

下調控制植酸合成最后階段的基因會降低轉基因水稻中植酸的濃度，同時提高無機磷酸鹽的含量。該突變不會影響種子的生長或發芽。

為了降低土壤中不易被植物吸收的植酸的水平，相關研究人員正在利用細菌植酸酶或含有高活性植酸酶的微生物（生物肥料）開發其他方法。為了實現這一目標，需要篩選出合適的土壤微生物作為生物肥料。

植酸酶也可用于工業和農業的其他領域。在紙漿和造紙行業中，將植酸酶用作具有木聚糖酶活性的未純化的或技術級的酶制劑的組成部分，能夠減少有毒化合物的形成，改善生態環境。眾所周知，從化學結構上來說有機磷殺蟲劑是一類亞磷酸酯，它們的毒性作用與抑制乙酰膽堿酯酶的活性有關。植酸酶能有效地降解有機磷殺蟲劑，如氯磷、單溴磷和甲基對硫磷。

植酸酶反應中形成的植酸衍生物在醫學上得到了廣泛的應用。肌醇可參與細胞信號傳導。它在脂質代謝中發揮著重要的作用，可降低糖尿病和腫瘤的發生風險。

植酸酶廣泛應用于人類生活的各個領域。當前，植酸酶在畜禽和水產動物養殖上的應用不僅能產生可觀的經濟效益，而且能保護生態安全。研發和引進新型植酸酶制劑，可為我們提供有利于生態安全的農業技術和工業技術。

（續完）

原題名：Phytases and the prospects for their application （Review）（英文）

原作者：N N Gessler等（俄羅斯）