疫霉菌有性生殖檢測體系的建立

朱香園

（長治市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗監(jiān)測中心，山西 長治 046000）

疫霉菌屬于藻界（Chromista），卵菌門（Oomycota），鞭毛菌亞門（Mastigomycotina），卵菌綱（Ommycetes），霜霉目（Peronosporales），腐霉科（Pyhiaceae），具有無性生殖和有性生殖兩種生殖方式[1]。馬鈴薯晚疫病就是該菌導(dǎo)致的，嚴重的可導(dǎo)致一個地區(qū)的馬鈴薯絕收[2]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌柱。本研究所用的馬鈴薯晚疫病菌—致病疫霉：BDTX5—1（A1）和HQK8—3（A2）。

1.1.2 供試培養(yǎng)基。黑麥—番茄培養(yǎng)基：900ml黑麥汁，100ml含0.4%CaCO3的番茄汁，瓊脂粉15g；燕麥—番茄培養(yǎng)基：900ml燕麥汁，100ml含0.4%CaCO3的番茄汁，瓊脂粉15g；以上培養(yǎng)基均是在121℃高壓下滅菌15min。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的選擇。同時制備燕麥—番茄培養(yǎng)基和黑麥—番茄培養(yǎng)基平板，然后將同一種菌種在同一時間點分別接種在這兩種培養(yǎng)基平板上，放于18℃的黑暗環(huán)境中培養(yǎng)，第三天的時候開始觀察不同培養(yǎng)基上菌落的生長狀態(tài)。并拍照。

1.2.2 致病疫霉A1和A2交配型菌株間卵孢子的產(chǎn)生。首先制備黑麥—番茄平板（9cm的培養(yǎng)皿）。分別將A1交配型和A2交配型的菌絲塊5mm×5mm×3mm，同時接種到同一平板上，兩個菌絲塊距平板中心約1.5cm，待兩個交配型的菌絲長的剛接觸到時在顯微鏡下觀察是否有卵孢子產(chǎn)生。

1.2.3 致病疫霉紙盤法有性生殖檢測體系的建立。①制備1000ml 1970 V8 黑麥培養(yǎng)液分裝到2個三角瓶中，每瓶500mL，121℃高壓滅菌15min后，冷卻至室溫。②將A1交配型的14塊5mm×5mm×3mm菌絲塊和A2交配型菌絲塊1塊接種到500mL的培養(yǎng)液里，黑暗培養(yǎng)17d（20℃，80rpm）。作為實驗組。③對照組的設(shè)置，將15塊5mm×5mm×3mm 的A2交配型菌絲塊接種到另一500ml的培養(yǎng)液里。以和實驗組同樣的條件進行培養(yǎng)。④17d后用定性濾紙將培養(yǎng)液中的菌絲體濾出，取出5 mL濾液過濾除菌后冷凍保存。其他培養(yǎng)液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮到5～10ml。將以上所得的慮液在置于冷凍干燥器中，進行冷凍干燥將最終得到粉末稱重。⑤用10 mL無菌水將得到的A1和A2兩個交配型粉末分別溶解，然后進行過濾除菌后分裝凍存。⑥將一塊A2交配型的5×5×3mm菌絲塊置于培養(yǎng)基中央（9cm的培養(yǎng)皿），18℃黑暗培養(yǎng)約10d。將第5步所得的液體滴在無菌濾紙片（Ф7mm）上，將濾紙片放于距培養(yǎng)皿中心約1.5cm的位置處（此時疫霉菌克隆的直徑約為40mm）培養(yǎng)7d，顯微鏡下觀察濾紙片覆蓋部位的卵孢子并計數(shù)。一個培養(yǎng)皿上可以放置6個濾紙片，設(shè)計成濃度梯度。其中一個是A2的濃縮培養(yǎng)液50μL，另外5個是A1的：一個為A1的最初培養(yǎng)液，其它四個為A1培養(yǎng)液濃縮后的液體，一個為濃縮液50μL，一個30 μL，一個20μL，一個10μL，不足50μL的體系用空白培養(yǎng)液補平）。該實驗做3個重復(fù)。⑦濾紙片放好后，在18℃黑暗條件下培養(yǎng)7天，顯微鏡下觀察濾紙片覆蓋部位的卵孢子并計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病疫霉培養(yǎng)基的選擇

以致病疫霉A2交配型菌株為代表，篩選適合的培養(yǎng)基。將A2交配型菌株分別接種在黑麥—番茄和燕麥—番茄培養(yǎng)基上，觀察其生長情況。燕麥—番茄培養(yǎng)基上生長的A2交配型菌落要比黑麥—番茄上的小。因此，黑麥—番茄培養(yǎng)基應(yīng)該更適合致病疫霉的生長。

2.2 致病疫霉A1和A2交配型菌株間卵孢子的產(chǎn)生

分別把A1和A2交配型菌株接種在同一塊培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)天，顯微鏡觀察交界面處卵孢子的產(chǎn)生情況。這兩株致病疫霉菌株可以通過菌株間的有性生殖產(chǎn)生卵孢子，可用于后續(xù)的實驗。

2.3 致病疫霉紙盤法有性生殖檢測體系的建立

三個重復(fù)中蘸有50 μL的A2濃縮培養(yǎng)液的濾紙片處均未產(chǎn)生卵孢子。同時也可以明顯看到隨著A1培養(yǎng)液濃度的增大，三個重復(fù)中每個濾紙片處的卵孢子數(shù)目也隨著增加。說明A1濃縮培養(yǎng)液中含有α1性激素，且其含量能夠誘導(dǎo)A2交配型菌株產(chǎn)生合適數(shù)量的卵孢子，可以用于未來的有性生殖檢測。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本研究主要是對疫霉菌的有性生殖檢測體系進行建立。結(jié)果表明，用濃縮的A1交配型菌株培養(yǎng)液可以有效誘導(dǎo)A2交配型菌株進行有性生殖并產(chǎn)生合適數(shù)量的卵孢子，說明紙盤法有性生殖檢測體系基本建立。

3.2 討論

A1和A2兩個交配型菌株單獨培養(yǎng)時都不能產(chǎn)生卵孢子，只會產(chǎn)生近梨形的孢子囊。當將A1和A2兩個交配型菌株接種在同一培養(yǎng)平板上，培養(yǎng)一段時間后發(fā)現(xiàn)兩個交配型菌株交界處有卵孢子產(chǎn)生，說明兩個菌株間可以進行有性生殖，本實驗所用的A1和A2兩個交配型菌株可用于進一步的實驗。

接下來我們嘗試利用濃縮的疫霉菌培養(yǎng)液建立疫霉菌紙盤法有性生殖檢測體系。實驗結(jié)果表明，不同量的A1交配型菌株的濃縮培養(yǎng)液都會誘導(dǎo)A2交配型菌株產(chǎn)生卵孢子，只是隨著濃縮培養(yǎng)液的量的減少產(chǎn)生的卵孢子的數(shù)量也在減少。