成纖維細胞活化蛋白對眼瞼基底細胞癌相關成纖維細胞增殖及凋亡的影響及機制研究

楊夏 張西 龍秋蓉

貴州醫科大學附屬醫院眼科（貴陽550004）

眼瞼基底細胞癌是眼瞼常見惡性腫瘤，常發生于表皮基底細胞或皮膚附屬器，發病緩慢，惡性程度和轉移程度較低，但可侵襲性破壞局部組織，影響患者眼部功能和面部外觀［1-2］。腫瘤微環境包括腫瘤周圍基質細胞及其分泌的細胞因子、趨化因子等，這些因素之間相互作用及信號轉導在腫瘤細胞生長過程中發揮關鍵作用［3］。成纖維細胞是最主要的基質細胞，在機體處于損傷、炎癥或腫瘤狀態下被激活，癌相關成纖維細胞（carcinomaassociated fibroblasts，CAFs）是腫瘤間質活化的成纖維細胞，具有成纖維細胞和平滑肌細胞共同特征，能為上皮細胞轉化提供促癌信號，在血管生成及腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲過程中發揮重要作用［4-5］。成纖維細胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP）是成纖維細胞活化后特異性表達的標志物，可增強腫瘤細胞侵襲力，促進腫瘤生長和增殖［6］。第10號染色體上磷酸酶和張力蛋白同源缺失的基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）是一種抑癌基因，主要通過抑制磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidyl inositol-3-kinase，PI3K）/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（serine-threonine protein kinase，AKT）通路在多種腫瘤組織中發揮抑癌作用［7］。既往人們對眼瞼基底細胞癌的研究多集中于癌細胞本身，對基質成纖維細胞關注較少，眼瞼基底細胞癌細胞學特征提示，CAFs可能與其發生發展過程有關，目前相關報道尚少，本研究通過分離、培養人眼瞼基底細胞癌CAFs，探討FAP對其細胞增殖和凋亡的影響及可能作用機制，旨在為臨床治療眼瞼基底細胞癌提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源選擇2018年6月至2019年8月期間本院收治的眼瞼基底細胞癌患者4例以及3例行上瞼皮膚松弛矯正術患者作為研究對象，患者均接受手術治療，收集手術切除組織，術后經病理學鑒定為眼瞼基底細胞癌和正常眼瞼皮膚。本研究經醫院倫理委員會審批通過，研究獲得患者同意并簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑FAP過表達、FAP shRNA及隨機序列shRNA慢病毒載體pLKO.1（美國Open biosystem公司），細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司），鼠抗人細胞角蛋白（cytokeratin，CK）單抗、鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）單抗、兔抗人波形蛋白（vimentin，VIM）單抗、兔抗人FAP多抗（北京中杉金橋生物技術有限公司），PTEN抑制劑bpv、兔抗人PTEN多抗、PI3K單抗、p-PI3K單抗、AKT多抗、p-AKT多抗（美國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離、培養將眼瞼基底細胞癌和正常眼瞼皮膚組織置于無菌條件下，PBS沖洗干凈，剪去多余上皮和脂肪組織，用眼科剪將剩余組織剪碎，平鋪于培養瓶中，加入DMEM培養基，于體積分數5%CO2，37 ℃培養箱內培養，2 ～3 d換液1次。獲得眼瞼CAFs和正常成纖維細胞（normal fibroblasts，NFs），于顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.2 細胞鑒定細胞培養到第3代，制作細胞爬片，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌；加入1%Triton X-100，室溫孵育5 min，PBS洗滌；3% H2O2封閉10 min，PBS洗滌；山羊血清封閉15 min；滴加1∶100稀釋的CK、α-SMA、VIM、FAP一抗（以PBS代替一抗作為陰性對照），4 ℃孵育過夜，PBS洗滌；滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌；滴加DAB顯色，自來水沖洗；蘇木素復染，封片，顯微鏡下觀察，細胞質中出現棕色顆粒判定為陽性。

1.2.3 細胞分組及干預取對數生長期第3代純化的眼瞼CAFs隨機分為對照組、過表達組、敲降組、空載組、抑制劑組，過表達組、敲降組、空載組細胞分別用含有FAP、FAP shRNA、空載隨機序列慢病毒轉染，抑制劑組轉染含有FAP shRNA的慢病毒，同時培養基中加入250 nmol/L的bpv，對照組不做轉染處理。48 h后，熒光顯微鏡下觀察轉染效率，均＞85%，可用于后續實驗。

1.2.4 眼瞼CAFs 增殖檢測各組細胞以1.0×104個/孔濃度接種于96孔板，每組設置5個復孔，置于體積分數5% CO2，37 ℃培養箱內分別培養24、48、72 h，每個時間點結束前4 h按20 μL/孔加入0.5 mg/mL的MTT溶液，繼續孵育4 h，棄上清，按150 μL/孔加入DMSO，震蕩10 min，以充分溶解結晶，使用酶標儀在490 nm處讀取各孔吸光度（A）值，以空白孔為對照，記錄數據，繪制生長曲線。

1.2.5 眼瞼CAFs 凋亡檢測各組細胞，PBS洗滌2次，1 000 r/min（離心半徑8 cm）離心5 min，加入Binding buffer重懸細胞，加入5 μL AnnexinV-FITC避光條件下4 ℃孵育15 min，加入10 μL PI核酸染料染色5 min，上流式細胞儀，檢測細胞凋亡情況。

1.2.6 眼瞼CAFs FAP、PTEN、PI3K、Akt、p-Akt蛋白水平檢測細胞加入RIPA裂解液，離心取上清，BCA法定量，配制蛋白樣品，100 ℃水浴變性，進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入FAP、PTEN、PI3K、Akt、p-Akt（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入HRP耦連的二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL發光液，曝光顯影，計算目的蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法采用SPSS 25.0統計學軟件分析數據，計量資料以均數±標準差表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察倒置顯微鏡下可見：眼瞼CAFs呈長梭形，細胞大小不一，數量較多，生長速度快，排列紊亂，喪失密度抑制和接觸抑制；NFs呈扁平狀，細胞大小接近，細胞數量較少，生長速度慢，排列規則，無重疊生長。見圖1。

圖1 細胞形態Fig.1 Cell morphology

2.2 眼瞼CAFs 鑒定CAFs和NFs均不表達CK，均表達VIM陽性；CAFs表達α-SMA、FAP陽性，NFs表達α-SMA、FAP陰性。見圖2。

圖2 免疫組化染色（SP×200）Fig.2 Immunohistochemical staining（SP×200）

2.3 眼瞼CAFs 增殖情況與對照組、空載組比較，過表達組24、48、72 h MTT實驗A值增大，敲降組及抑制劑組24、48、72 h MTT實驗A值減小（P ＜0.05）；抑制劑組24、48、72 h MTT實驗A值大于敲降組（P ＜0.05）。見圖3。

2.4 眼瞼CAFs 凋亡情況與對照組、空載組比較，過表達組凋亡率降低，敲降組、抑制劑組凋亡率升高（P ＜0.05）；抑制劑組凋亡率低于敲降組（P ＜0.05）。見圖4。

2.5 眼瞼CAFs FAP、PTEN、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達與對照組、空載組比較，過表達組FAP、p-PI3K、p-Akt表達升高，PTEN表達降低，敲降組、抑制劑組FAP、p-PI3K、p-Akt表達降低，PTEN表達升高（P ＜0.05）；抑制劑組PTEN表達低于敲降組，p-PI3K、p-Akt高于敲降組（P ＜0.05）。見圖5。

圖3 CAFs 生長曲線Fig.3 CAFs growth curve

圖4 細胞凋亡率比較Fig.4 Comparison of apoptosis rates

圖5 細胞中蛋白表達Fig.5 Expression levels of various proteins in cells

3 討論

眼瞼基底細胞癌病因復雜，與放射線、紫外線、砷制劑、遺傳等因素有關，臨床治療以手術切除為主，部分患者術后存在局部復發現象，放射治療可減少術后復發率，但易引起放射性角膜炎、白內障等其他眼部并發癥［8］。CAFs是腫瘤微環境中最豐富的細胞，其標志著細胞間質被激活，FAP在多數上皮細胞癌CAFs和部分腫瘤細胞間質中高表達，與血管生成、腫瘤增殖及細胞外基質侵襲、重塑之間關系密切，研究FAP對CAFs增殖、凋亡等生物學特征的影響，對治療眼瞼基底細胞癌有重要臨床意義［9］。

本研究成功培養出眼瞼CAFs和NFs，顯微鏡下CAFs與NFs形態上差異顯CAFs喪失接觸抑制和密度抑制。CAFs與NFs同屬于成纖維細胞，均不表達上皮細胞標志物CK，表達成纖維細胞標志物VIM，同時CAFs還可特異性表達α-SMA和FAP，既往研究均已證實α-SMA和FAP在NFs中不表達或極低表達，免疫組化方法無法檢出［10］。本研究經免疫組化染色，結果顯示，CAFs除表達CK陰性外，VIM、α-SMA和FAP均表達陽性，而NFs只有VIM表達陽性。研究顯示，來源口腔癌、前列腺癌的CAFs表達α-SMA和FAP陽性［11］，本研究與其他腫瘤來源CAFs特性一致，成功分離純化CAFs，并與NFs作出區別，進一步研究其增殖、凋亡情況。

腫瘤微環境中基質細胞功能變化會影響腫瘤細胞惡性生物潛能，癌組織中成纖維細胞CAFs能提高腫瘤細胞免疫力和抵抗力。FAP是CAFs活化的特異性標志物，在正常成纖維組織中不表達，在卵巢癌、乳腺癌等上皮惡性腫瘤的基質成纖維細胞中高表達，可以促進成纖維細胞增殖，改變腫瘤微環境，激活鄰近上皮細胞內增長信號，增加腫瘤細胞惡性表型，參與腫瘤發生發展過程［12-13］。CAFs是腫瘤微環境中主要基質細胞，參與腫瘤細胞外基質合成、降解、分布，并與腫瘤細胞增殖、侵襲等生物學行為密切相關。FAP由CAFs分泌，同時又可以反過來促進CAFs增殖，抑制其凋亡，增加腫瘤微環境中FAP濃度，從而促進腫瘤細胞惡性潛能［14］。表達FAP是CAFs主要特征之一，FAP陽性的間質細胞是腫瘤基質主要成分，FAP促進CAFs增殖，引起FAP分泌增加，且FAP基因組穩定，不易耐藥，表面抗原表達穩定，可以作為腫瘤免疫診治靶分子。本研究過表達組CAFs A值升高，凋亡率下降，通過敲降FAP基因后，A值降低，凋亡率升高，提示過表達FAP促進CAFs增殖，抑制細胞凋亡。

PTEN/PI3K/Akt通路是細胞內重要信號轉導通路之一，通路表達異常與糖尿病等多種疾病有關，同時與腫瘤發展有密切關系，在細胞增殖中發揮重要作用［15］。PTEN是一種抑癌基因，在細胞增殖、凋亡等過程中發揮調控作用。PI3K參與多種細胞調控，Akt是PI3K下游靶蛋白，通過調節下游分子目標，抑制細胞凋亡，促進惡性腫瘤發展。PTEN是PI3K/Akt通路重要的負性調節劑，通過去磷酸化PI3K底物，抑制Akt及其下游分子活化，誘導細胞凋亡。研究表明，PTEN/PI3K/Akt信號通路通過阻滯細胞周期，參與誘導小鼠骨髓細胞的凋亡［16］。上調PTEN表達，可負性抑制PI3K/Akt通路，抑制膽管癌細胞增殖［17］。本研究過表達組PTEN表達顯著降低，激活PI3K/Akt通路，促進CAFs增殖，抑制其凋亡，敲降FAP基因后，PTEN表達升高，阻滯PI3K/Akt通路，減少CAFs增殖，在敲降FAP基因基礎上加入PTEN抑制劑，可促進CAFs增殖，提示過表達FAP通過調節PTEN/PI3K/Akt信號通路促進CAFs增殖，抑制其凋亡。PTEN在多種腫瘤或癌相關成纖維組織中低表達，通過激活PI3K/Akt通路促進細胞增殖［18］。PTEN促進CAFs增殖并抑制其凋亡，引起腫瘤微環境失衡，從而影響腫瘤細胞或癌細胞惡性生物學行為。

綜上所述，過表達FAP可能通過調控PTEN/PI3K/Akt信號通路促進眼瞼CAFs增殖，抑制其凋亡，顯示出其診斷治療眼瞼基底細胞癌的潛能，FAP對眼瞼CAFs侵襲及遷移作用還需進一步研究，可能為臨床提供新靶點。