Time-lapse 培養與常規培養卵裂期胚胎移植的妊娠及新生兒結局分析

紀冰 馬學工 李斌業 呂金春 李曉娜

青海省人民醫院生殖中心（西寧810007）

時差成像（time-lapse，TL）技術是一種新型胚胎培養與胚胎實時觀察技術。與需要將胚胎反復取出培養箱且只能在特定時間點靜態觀察胚胎的常規培養相比，TL培養系統既能保證足夠穩定的胚胎培養環境，又能提供全面的胚胎發育動態信息，有利于改善胚胎質量，并能選擇出更具發育潛能的胚胎，提高IVF妊娠結局［1-3］。但也有學者認為，TL培養箱中的高頻率曝光拍攝環境或存在的電磁場可能對胚胎發育及其子代有害［4］。近年來針對TL安全性的研究大多局限于其對胚胎質量及妊娠率的影響，而有關應用該技術出生子代情況的研究較匱乏。因此，本文就接受IVF/ICSI助孕的1 999周期資料進行回顧性分析，比較兩種培養方法行卵裂期胚胎移植后的妊娠結局及新生兒情況，進而探討與評估TL技術的安全性和有效性。

1 資料與方法

1.1 一般資料2016年1月至2019年3月在青海省人民醫院生殖中心行IVF-ET/ICSI-ET助孕的病例共1 999周期，隨機分配患者胚胎的培養方式，其中TL培養組871周期，常規培養組1 128周期。納入標準：（1）女方年齡40歲；（2）D3卵裂期胚胎移植；（3）排除子宮畸形、子宮肌瘤、復發性流產等預后不良的患者；（4）IVF/ICSI周期數2周期。

1.2 研究方法

1.2.1 胚胎培養方法根據患者基礎內分泌、卵巢儲備等情況按照我中心常規進行超促排卵，當1 ～2枚卵泡直徑18 mm時注射HCG 5 000 ～10 000 IU，36 ～38 h陰道B超引導下行取卵術，所獲卵母細胞IVF或ICSI受精。授精后18 ～20 h，常規培養組將放入受精卵的微滴培養皿置于AD-3 100培養箱（6%CO2，5%O2，37 ℃）培養，在授精后44 h和68 h左右觀察胚胎；TL培養組將放入受精卵的Culture Coin專用培養皿置于ESCO（6% CO2，5%O2，37 ℃）培養箱培養，拍攝間隔設置為5 min［5］。每日評估胚胎發育情況，第3天選擇1 ～3枚評分最高的胚胎。

1.2.2 胚胎質量評估常規組與TL組均參考Istanbul共識，根據卵裂球數目、碎片及卵裂球均一性等胚胎形態學方法評分［6］。TL組將卵子加入精液微滴或將精子注入卵子的時間設置為時間起點0，標注胚胎發育時間參數，包括原核消失時間（PNF）、胚胎發育至2、3、4、5細胞的時間（t2、t3、t4、t5）、2細胞發育至3細胞的時間（cc2）、3細胞發育至4細胞的時間（s2）；記錄胚胎卵裂模式，包括正常卵裂和異常卵裂（非二倍卵裂、發育阻滯、非對稱卵裂、卵裂球融合等）。

1.2.3 胚胎移植的選擇第3天常規組選擇1 ～3枚評分最高的胚胎移植；TL組移植胚胎篩選范圍為：形態學評分最高且卵裂模式為正常卵裂、非軸性或不均卵裂，時間參數符合t5 54.95 h和cc2 12.17 h，如無符合上述篩選條件的胚胎，則不納入研究范圍，移植后常規黃體支持。

1.2.4 妊娠結局判斷及隨訪移植后14 d測血和尿HCG，28 d B超檢查若見孕囊及胎心，則視為臨床妊娠。對臨床妊娠患者進行定期隨訪至新生兒出生。

1.3 觀察指標觀察兩組妊娠及新生兒結局的各項指標。活產率：分娩活胎周期/移植周期；抱嬰回家率：至少有1例新生兒存活并抱回家的周期/移植周期；不良新生兒結局：32周前的早產或轉院新生兒或無抱嬰回家；低體質量兒：出生體質量＜2 500 g；超低體質量兒：出生體質量＜1 500 g；巨大兒：出生體重＞4 000 g。

1.4 統計學方法應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。正態分布計量資料采用t檢驗，定性資料采用χ2檢驗，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者基本資料TL組與常規組的女方年齡、不孕年限、女方體質指數（BMI）、不孕類型、不孕因素、助孕方式差異均無統計學意義（P ＞0.05），見表1。

表1 兩組患者基本資料比較Tab.1 Comparison of basic data between the two groups例（%）

2.2 兩組妊娠結局比較兩組移植日內膜、異位妊娠率、早期流產率、晚期流產率、多胎率之間差異均無統計學意義（P ＞0.05）。TL組的移植胚胎數明顯少于常規組，差異有統計學意義（P ＜0.05）。TL組的臨床妊娠率、著床率、活產率及抱嬰回家率明顯高于常規組，差異有統計學意義（P ＜0.05），見表2。

2.3 兩組新生兒情況比較TL組雙胎112例，共出生224例新生兒；單胎258例，出生258例新生兒。常規組雙胎108例，共出生216例新生兒；單胎300例，出生300例新生兒。兩組的早產率、不良新生兒結局、低體質量兒、極低體質量兒、巨大兒、分娩孕周、新生兒體重、畸形率及男女性別比之間差異均無統計學意義（P ＞0.05），見表3。

3 討論

TL培養技術應用于臨床以來，其有效性和安全性一直備受關注，是輔助生殖領域研究的熱點［7-9］。

表2 兩組妊娠結局的比較Tab.2 Comparison of pregnancy outcomes between the two groups 例（%）

表3 兩組新生兒情況比較Tab.3 Comparison of newborn between the two groups

3.1 TL對IVF妊娠結局的影響PRIBENSZKY等［3］的一項隨機對照研究表明，與常規培養相比，TL培養可顯著提高臨床妊娠率（51.0% vs. 39.9%，P ＜0.05），顯著降低早期流產率（15.3% vs. 21.3%，P ＜0.05）和顯著增加活產率（44.2%vs.31.3%，P ＜0.05）。KALLEAS等［10］的研究顯示，與使用常規培養的患者相比，使用TL培養的患者的活產率顯著升高，早期流產率顯著降低。本研究中，TL組的平均移植胚胎數明顯低于常規組（P ＜0.05），但妊娠率、著床率、活產率及抱嬰回家率明顯高于常規組（P ＜0.05），說明經TL培養及篩選出的胚胎具有更好的發育潛能，能明顯改善IVF妊娠結局，提示TL可作為卵裂期單胚胎移植的篩選方法。較高的流產率是輔助生殖技術無法規避的難題，也極大地損害了患者身心健康，早期流產主要與胚胎質量尤其是胚胎染色體異常有關。本研究結果顯示，與常規組相比，TL組的早期流產率并未降低（P ＞0.05）。染色體異常的胚胎可能會出現異常分裂現象，如非二倍卵裂、卵裂球融合、胚胎多核現象等［11-12］。本研究TL組選擇移植胚胎時已將此類胚胎進行排除，但移植后的早期流產率仍居高不下，可能是本中心目前對TL提供的胚胎發育信息的研究尚不夠全面，部分染色體異常的胚胎無法用相關的胚胎動力學參數甄別所致。由此可見，為了盡可能降低早期胚胎丟失，將其轉化為活產，應充分明確胚胎發育中各參數的意義，為胚胎選擇提供參考。

3.2 TL 對新生兒的影響隨著TL應用的普及，通過該技術培養及選擇胚胎移植的新生兒出生情況是輔助生殖工作者日益關注的問題。2017年INSUA等［13］首次報道了針對時差監測系統對新生兒結局的隨機研究，分析216例TL培養與162例傳統培養的單胎妊娠產科和圍產期結局，發現兩組的新生兒出生體重、低體重兒比例、極低體重兒比例及早產率差異均無統計學意義。本研究顯示，TL組單胎妊娠及雙胎妊娠圍生期結局的各項指標均與常規組差異無統計學意義，在結果中并未觀察到有害的圍產期結局，這也就說明了TL胚胎培養方式和培養環境并未對胎兒在宮內的生長發育及新生兒的產科結局產生不利影響。但MASCARENHA等［14］研究發現，與常規培養相比，TL培養可改善IVF的圍生結局，主要表現為較低的早產率和更高的新生兒平均出生體重，與本次研究結果不同，這可能是由于數據樣本量以及其他因素不同造成的，這就需要后期收集更多的樣本量并且統一數據納入標準等來進行進一步的驗證。眾所周知，雙胎妊娠是IVF的嚴重并發癥之一，會顯著增加母兒的不良圍產期及產科結局［15-17］，因此充分利用TL提供的胚胎動力學參數建立合理有效的胚胎篩選模式，減少移植胚胎數目，降低多胎風險，保證IVF母嬰安全與健康。

自然妊娠狀態下男女嬰兒的出生比例為106～110.2∶100［18］，有研究發現，常規培養周期行卵裂期胚胎移植并不會加大新生兒性別比［19-20］，本研究中常規組性別比為110∶100，與報道相接近，但TL組的性別比高達130∶100，雖然在此次研究中，兩組的新生兒性別比差異無統計學意義（P ＞0.05），但較常規組有升高趨勢。TL組選擇移植胚胎不僅考慮胚胎形態，還需參考胚胎動力學參數，而胚胎動力學參數又因各中心患者情況、培養條件、人員操作等因素影響各不相同［21-22］，尚未形成統一標準。因此TL組性別比偏高可能與本研究根據TL提供的胚胎動力學參數而建立的胚胎篩選模式存在潛在的性別偏差或樣本量太少有關，具體原因尚需多中心、大樣本的研究。

綜上所述，TL培養對IVF的妊娠圍產結局并無不良影響，是進行胚胎培養的有效和安全方法。但目前TL技術在臨床的應用時間較短，尚無法確定其對出生子代的遠期健康風險，這也是本研究的不足之處及需要后期進一步探索的方向，因此今后需建立更加長期完善的隨訪制度，觀察子代健康狀況，以便對TL技術的安全性做出更全面的評估。