氮摻雜碳納米酶聯合近紅外光抗真菌體外試驗研究

余 凡 蘇 欣 安蘭芳 周絲雨 高利增 朱曉芳

1大連醫科大學，遼寧大連，116044；2揚州大學醫學院，江蘇揚州，225001；3中南大學湘雅二醫院，湖南長沙，410011；4中國科學院生物物理研究所中國科學院納米酶工程實驗室，北京，100101；5揚州大學臨床醫學院皮膚科，江蘇揚州，225001

納米酶是一類具有類酶活性的納米材料[1]，廣泛應用于生物醫學領域，在抗腫瘤和抗菌方面取得了一定的成果[2-7]。納米酶可以通過不同的操作(包括磁場、光、超聲和熱)來進行遠程控制[8]，其酶活性也可以通過外部物理或生物刺激(例如光或pH)來調節[9]。氮摻雜碳納米酶(nitrogen-doped carbon nanozyme, N-Carbon nanozyme)是一種新興的納米酶，具有四種酶樣活性：氧化酶，過氧化物酶，過氧化氫酶和超氧化物歧化酶，能夠催化活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的產生和清除[10]。

最近，利用光吸收劑吸收光能并釋放熱能的光熱療法(photothermal therapy, PTT)已經廣泛應用于多個領域。PTT具有許多優點，例如微創性、不良反應少以及時空選擇性的優點[11]。基于各種碳材料(如碳納米管和石墨烯材料)的PTT已被研究用于癌癥治療、藥物輸送和抗菌治療[12]。

N-Carbon nanozyme不僅具有酶催化活性，還具有光熱效應，而近紅外光(near infrared, NIR)具有顯著的熱效應。因此，在本論文中我們以白念珠菌和紅色毛癬菌為研究對象，進行了N-Carbon nanozyme聯合808 nmNIR體外抗真菌實驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株 紅色毛癬菌(ATCC MYA 4438)購自中國醫學科學院皮膚病研究所；白念珠菌(ATCC 10231)購自中國科學院微生物研究所。

1.1.2 主要試劑 戊二醛，福爾馬林水溶液(37wt%)，苯酚和三聚氰胺購自國藥集團化學試劑有限公司，三嵌段共聚物Pluronic F127(MW=12600，PEO106PPO70-PEO106)購自Acros Organics(美國)，PI熒光染料購自Invitrogen(美國)，SYTO 9綠色熒光核酸染料購自Life Technologies Corporation。

馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(SDA)、沙氏葡萄糖液體培養基(SDB)按照標準制備。

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化 所有實驗用菌株接種在PDA斜面培養基上，活化2次(白念珠菌在37℃培養2 d，紅色毛癬菌在28℃培養7～14 d)。

1.2.2 菌懸液的制備 紅色毛癬菌：取活化好的紅色毛癬菌標準菌株，加入無菌生理鹽水1 mL，用刮勺輕輕搔刮真菌菌落，將所得混懸液靜置15 min沉淀菌絲，取上清液，采用分光光度計在600 nm處，調整菌懸液至0.5個麥氏單位濁度，相當于(1～5)×106CFU/mL，備用。

白念珠菌：挑取白念珠菌菌落，接種于5 mL SDB培養液中，于37℃震蕩培養，活化2次，培養24 h使真菌處于對數生長期。采用分光光度計在600 nm處，調整菌懸液至0.7個麥氏單位濁度，相當于(1～5)×107CFU/mL，備用。

1.2.3 N-Carbon nanozyme的制備和表征 我們分別以含有三聚氰胺和福爾馬林/苯酚的F127軟模板為氮和碳源，根據文獻報道[13-15]，采用熱解法制備N-Carbon nanozyme。N-Carbon nanozyme的表征采用場發射掃描電鏡(S-4800II，Hitachi，日本)和透射電鏡(Tecnai 12，Philips，荷蘭)進行觀察。

1.2.4 N-Carbon nanozyme濃度及NIR照射能量的篩選 取白念珠菌菌懸液，分別固定N-Carbon nanozyme濃度、NIR照射功率及時長中的2個變量進行試驗，總計反應30 min，稀釋后取100 μL均勻涂布于SDA培養基平板上，每組重復2次，于37℃培養箱培養36 h后數菌。最后選擇N-Carbon nanozyme的濃度為250 μg/mL，NIR的功率為2.5 W/cm2，照光時長為8 min。

1.2.5 體外抗真菌試驗分組 取培養好的真菌隨機分為四組：(1)空白對照組：僅真菌，不進行任何處理；(2)光照組：用功率為2.5 W/cm2的NIR照射真菌8 min；(3)材料組：真菌中加入250 μg/mL的N-Carbon nanozyme處理30 min；(4)實驗組：真菌中加入250 μg/mL的N-Carbon nanozyme，同時進行NIR照射8 min。

1.2.6 體外抗真菌效果判斷 本研究中抗真菌活性觀察采用共聚焦熒光染色，因有活性和無活性真菌的細胞膜通透性存在差異，使用SYTO 9/PI染色可以判斷菌體活性的變化。SYTO 9核酸染色劑是一種綠色熒光染料，可以對活細胞和死細胞進行染色以定位真菌[16]。PI是一種紅色熒光染料，僅能穿透受損細胞膜對核酸進行染色，因此可標記死細胞[17]。對白念珠菌抗菌活性研究還采用了掃描電鏡觀察形態以及平板計數法，根據菌落形成單位(CFU)的數量來判定(該實驗重復3遍)。

共聚焦熒光測定：24孔板中，放入無菌玻片，白念珠菌、紅色毛癬菌各分為4組，每組設3個復孔，白念珠菌在SDB中培養36 h，紅色毛癬菌在SDB中培養7 d，經各組實驗處理結束后，用PI染色20 min，然后SYTO 9復染10 min后，用共聚焦熒光顯微鏡(TCS SP8 STED，Leica，德國)來觀察。該實驗重復3遍。

掃描電鏡觀察：白念珠菌培養同上，經各組實驗作用結束后，用2.5%戊二醛固定。然后，將細胞通過一系列乙醇/水混合物進行梯度脫水，并通過CO2超臨界干燥。最后，使用場發射掃描電鏡(GeminiSEM 300，Zeiss，英國)觀察所獲得的干燥真菌。該實驗重復3遍。

1.2.7 統計學方法 本研究部分數據結果采用SPSS 19進行單因素方差分析，兩兩之間比較采用LSD-t方法，檢驗水準為α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 N-Carbon nanozyme的表征 通過透射電鏡、掃描電鏡觀察，碳納米球表現出基本統一的大小，直徑約為(150±10)nm，并且表面表現出多孔結構的特點(圖1)。

1a：掃描電鏡圖像；1b：透射電鏡圖像

2.2 N-Carbon nanozyme的光熱效應觀察 N-Carbon nanozyme經NIR照射后，可以將近紅外光轉換為熱能。隨著N-Carbon nanozyme濃度的增加溫度升高更明顯，可見光熱轉換效率具有濃度依賴性(圖2a)。N-Carbon nanozyme濃度固定的情況下，NIR的功率越高溫度升高越明顯，可見光熱轉換效率也與功率的強度有關(圖2b)。

2a：在NIR(2.5 W/cm2)照射下，不同濃度的N-Carbon nanozyme的溫度升高情況；2b：250 μg/mL的N-Carbon nanozyme在NIR不同能量密度照射下的溫度升高情況

2.3 N-Carbon nanozyme聯合NIR對白念珠菌的抑菌作用 根據平板計數法來直觀地觀察N-Carbon nanozyme及NIR對白念珠菌的抑菌效果。結果如圖3a、4a，與空白對照組相比，光照組和材料組中白念珠菌的存活率仍高，未見明顯死亡。而實驗組中白念珠菌的活力明顯降低，抑菌率為99.9%以上，降低了至少3-log10(P<0.0001)。而且，N-Carbon nanozyme聯合NIR的抗菌能力，與N-Carbon nanozyme的濃度(圖4c)和NIR照射的能量密度有關(圖4d)。同時，為了進一步了解加熱對白念珠菌的影響，我們進行了對比測試。因N-Carbon nanozyme經NIR照射8 min誘導的溫度約為50℃，所以設置50℃水浴對照組。結果如圖3b、4b，與空白對照組相比，溫度對照組和實驗組中白念珠菌的活力均明顯降低(P<0.001)。雖然水浴的外部加熱確實會誘導白念珠菌的死亡，但抗菌效果不如實驗組(P<0.0001)。

為進一步驗證N-Carbon nanozyme的光熱抗菌作用，將經各組實驗處理后的白念珠菌樣品使用SYTO 9/PI進行染色，通過共聚焦顯微鏡收集熒光圖像。如圖5，空白對照組幾乎沒有紅色熒光，而光照組和材料組可見少量紅色熒光，說明很大比例的白念珠菌仍然存活。相反，在實驗組的圖像中能觀察到明顯的紅色熒光，這意味著幾乎所有的真菌都被光熱處理殺滅。因此，所有結果表明，借助于808 nm的近紅外光照射，N-Carbon nanozyme具有高效的抗真菌能力。

同時，我們運用掃描電鏡觀察經各組實驗處理后的白念珠菌的形態變化，進一步探討N-Carbon nanozyme聯合NIR對白念珠菌的影響。如圖6，對照組中的白念珠菌表現出典型的球狀形狀，細胞壁完整且光滑；光照組和材料組中白念珠菌沒有顯示出可觀察到的壁損傷或細胞死亡。但是，實驗組中可觀察到，盡管某些真菌細胞仍保持其完整性，但細胞形態發生明顯的改變，變得粗糙及皺縮。

2.4 N-Carbon nanozyme聯合NIR對紅色毛癬菌的抑菌效果 我們運用SYTO 9/PI死活染色法對處理后的的紅色毛癬菌樣品進行染色。結果如圖7，空白對照組、光照組及材料組均存在部分紅色熒光，但仍有很大比例的紅色毛癬菌存活。相反，在實驗組中，觀察到較大比例的紅色熒光，這意味著大部分的紅色毛癬菌被光熱處理殺滅。

3a：光照組、材料組與空白對照組間菌落數未見明顯差異，而實驗組可見菌落明顯減少;3b：與空白對照組相比，實驗組、溫度對照組(50℃水浴8 min)的菌落數均見明顯減少，而實驗組與溫度對照組相比，減少更明顯

4a：白念珠菌在經NIR或(和)N-Carbon nanozyme處理后的菌體活力；4b：白念珠菌在50℃水浴(8 min)與經N-Carbon nanozyme+NIR處理后的菌體活力；4c：在NIR(2.5 W/cm2，8 min)照射下，白念珠菌經不同濃度的N-Carbon nanozyme處理后的菌體活力；4d：白念珠菌經NIR(8 min)不同能量密度及N-Carbon nanozyme(250 μg/mL)處理后的菌體活力 注：“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001，“****”表示P<0.0001

綠色定位所有白念珠菌，紅色代表死亡白念珠菌；其中空白對照組幾乎沒有紅色熒光，而光照組和材料組可見少量紅色熒光，試驗組見大量紅色熒光

3 討論

皮膚淺部真菌感染主要侵犯皮膚、黏膜、毛發和甲，病原體主要以皮膚癬菌為主，其次是念珠菌，且現在念珠菌感染有逐漸上升趨勢[18,19]?，F因多種因素導致淺部真菌感染的發生越來越多，雖然危害小，但也嚴重影響患者的生活質量[20]。同時因為患者不規范用藥，誘導耐藥菌株的產生，也為臨床診斷和治療增加了困難。而開發高效、低毒、廣譜且廉價的抗真菌藥物是全球關注的熱點。

6a:對照組中的白念珠菌表現出典型的球狀形狀，細胞壁完整且光滑；6b、6c:光照組和材料組的白念珠菌未見明顯改變；6d:實驗組白念珠菌細胞表面變得粗糙及皺縮

N-Carbon nanozyme作為新興的納米酶，可以調節ROS的產生和清除，雜原子氮摻雜和石墨結構都是實現上述類酶活性的必要條件，而其結構的多孔性提高了它們的活性。因為多孔界面提供了大量的活性位點，有利于催化過程中的質量運輸[10]。同時碳納米材料能吸收某種波段的光尤其是NIR的能量，通過等離子體共振或者能量躍遷帶，將吸收的光轉化為熱能，從而導致局部高溫[21]。

本研究表明，N-Carbon nanozyme聯合近紅外光對白念珠菌及紅色毛癬菌均有明顯的抗菌作用，通過吸收光能迅速轉換為熱能，導致真菌細胞壁及細胞膜的破壞。但因為水浴加熱的抑菌效果明顯不如N-Carbon nanozyme聯合NIR的抑菌效果，因此，我們需要深入分析NIR照射N-Carbon nanozyme后產生的熱量對真菌活力的影響。首先，使用水浴的加熱方式是外部的；NIR照射時的加熱是內部的，濃縮在N-Carbon nanozyme的表面上。而且，在某些時候，N-Carbon nanozyme的表面溫度可能高于本體溶液中的溫度。此外，N-Carbon nanozyme還可能黏附在真菌壁上，這種相對較高的表面溫度有利于破壞細胞壁，最終殺死真菌。其次，這兩條加熱路線之間的差異也提醒我們，加熱可能不是光熱抗菌療法的唯一因素?？紤]到N-Carbon nanozyme在一定條件下表現出多種酶樣活性，推測其抗真菌的機制除熱損傷外還包括：(1)高水平ROS破壞真菌膜，導致細胞內基質滲漏，致使真菌細胞失活。同時，DNA也受影響而裂解；(2)可能破壞真菌體內的氧化還原平衡，導致真菌快速死亡[22]。不過具體作用機制還需要進一步的研究來驗證。N-Carbon nanozyme經NIR照射8 min誘導的溫度約為50℃，而人體皮膚的最高耐受溫度約為46℃，因此我們后續需要在材料上或光照參數上進一步優化，以期實現在機體耐受溫度范圍內達到最佳抗真菌效果。本研究中關于N-Carbon nanozyme抗紅色毛癬菌無直觀的抑菌效果分析，主要限于紅色毛癬菌的形態特異性、材料的顆粒性和有色性以及808 nm激光器照光條件(光斑直徑約5 mm)，無法使用常規的抗真菌藥敏試驗M38-A2方案及平板計數法等多種方法，需要探索其他切實可行的方法來驗證N-Carbon nanozyme聯合NIR抗皮膚癬菌的效果。

綠色定位所有紅色毛癬菌，紅色代表死亡紅色毛癬菌；其中空白對照組、光照組和材料組可見少量紅色熒光，試驗組見大量紅色熒光

我們的研究結果初步表明N-Carbon nanozyme聯合NIR對白念珠菌及紅色毛癬菌均有明顯的抑制效果，但如何選擇材料的濃度及NIR的能量密度、時長等是關鍵，需要做到對真菌造成最大損傷的同時盡可能減小對人體的傷害。目前已有研究報道在鐵蛋白的引導下，N-Carbon nanozyme在人類腫瘤異種移植小鼠模型的體內試驗中能靶向腫瘤細胞，產生活性氧，從而有效抑制腫瘤細胞，重要的是，N-Carbon nanozyme在生理條件下會降解[10]。那么我們也可以試想，是否也可以運用某種靶向因子，特定作用于真菌細胞，減少對宿主的傷害，而皮膚淺表真菌感染位于體表，應用相對容易實現，也比較安全。因此，N-Carbon nanozyme聯合NIR抗真菌是一個研究方向，具有潛在的應用前景。