鼻腦型毛霉病病原菌及發病機制研究進展

馮亞輝 李秀國 史冬梅

1濟寧醫學院，山東濟寧，272001；2濟寧市第一人民醫院耳鼻喉科，山東濟寧，272001；3濟寧市第一人民醫院皮膚科，濟寧市第一人民醫院醫學真菌實驗室，山東濟寧，272001

毛霉病是毛霉目真菌感染引起的一種致死性真菌感染性疾病。按照感染部位分為鼻腦型、肺型、胃腸型、皮膚型、播散型等，其中鼻腦型毛霉病最為常見。鼻腦型毛霉病是特指毛霉菌通過皮膚黏膜交界處進入鼻腔，蔓延至上顎、鼻竇、眼眶，最后因血管侵襲或骨質破壞引起顱內感染的一種毛霉病。鼻腦型毛霉病臨床表現為鼻部及周邊軟組織為中心的劇烈炎癥，真菌進一步侵襲出現血管栓塞、組織壞死，引起一系列癥狀和體征。本病通常急性起病，但也有少數呈現慢性病程。存在基礎疾病或不正確干預，本病可迅速進展，數天至數周即可造成死亡。

1 病原菌

1.1 病原菌概況 毛霉目真菌菌絲發達，大多數腐生，少數可寄生于人、種子植物或其它真菌上。毛霉病最常見致病菌為根霉、毛霉和橫梗霉屬，其次是根毛霉、小克銀漢霉屬、鱗質霉菌屬、瓶霉菌屬[1-3]。筆者根據全球病原學薈萃分析結果繪制致病菌區域分布圖[4](圖1)，分析發現根霉屬依舊為世界范圍內最常見的毛霉病病原菌，也是鼻腦型毛霉病最常見的致病菌。近年來，由橫梗霉屬與鱗質霉屬造成的感染病例在亞歐地區開始增多[5]。西班牙一家醫院調查發現橫梗霉屬是該區域毛霉病的主要病原菌[6]；加拿大安大略省的一項區域回顧顯示，該地鼻腦型毛霉菌病90%是由根霉屬感染所致[7]。我國毛霉病中常見的致病菌以多變根毛霉(現更名為不規則毛霉)最為常見，其次為米根霉[8]；但米根霉是鼻腦型毛霉病最常見的病原菌。上述綜合證據表明毛霉病致病菌種在全球分布既具有統一性，又存在地域間差異。

全球毛霉病的整體病死率為40%～80%，與患者的基礎情況和感染類型有直接相關性[6,9]。毛霉病的常見分型中鼻腦型毛霉病占比為34%，遠高于皮膚型(22%)與肺型(20%)。鼻腦型毛霉病發病初期(1～4周)總體生存率約占確診病例的59.5%，且與患者不同的基礎狀況與接受的治療有關，面部大面積壞死和神經系統受累仍是預后較差的指標(存活率分別為33%和39%)。盡早開始治療對生存率也有相當大的影響，發病前12天內的積極治療生存率可提升至61%，相反未早期治療或未治療患者生存率僅為20%[10]。因此正確診斷、及時治療顯得尤為重要。

圖1 全球不同區域毛霉病病原體分布圖

1.2 病原菌的感染途徑 毛霉目真菌多為環境菌或發酵菌種，空氣中有孢子分布，患者由于吸入空氣中的孢子而感染。在有易感因素人群中，感染部位存在有利于毛霉菌生長的微環境，孢子便可局部定植，菌絲可直接沿血管侵襲或孢子通過血液循環向周圍組織蔓延。通常先累及鼻腔、鼻甲及口腔、上頜竇、嘴唇等微循環豐富軟組織，隨后菌絲進一步擴散侵襲蝶竇、海綿竇、額竇、顱骨底，進而感染眼球或顱內。

對于無易感因素人群，報道的感染途徑主要與損傷有關，包括外傷(如自然災害、機動車事故、戰區簡易爆炸裝置或醫源性損傷)、手術或燒傷[11-13]。

1.3 病原菌的檢查與鑒定

1.3.1 組織病理學檢查 通過病理學檢查診斷真菌感染，則需對局部切除或穿刺活檢的組織進行特殊染色，通常情況下可采用HE、PAS及GMS染色。毛霉菌感染在組織中呈現菌絲結構，HE染色較淡，PAS染色最為清晰，也是首選的染色方法。組織病理學上，毛霉菌菌絲的寬度可變，為6～16 μm，但也可寬達30 μm，且無分隔或少分隔。在組織中，菌絲具有不規則的分枝，但多呈90度分枝[14]。在病理模式中，毛霉菌病病理具有相應特征性，在急性起病的感染組織中，可見到出血性梗死、凝固性壞死、血管浸潤、中性粒細胞浸潤和侵犯神經結構等相對特征性的改變[15-18]。國外報道的局灶性慢性鼻腦型毛霉病，其組織病理多表現為以多核巨細胞為主的慢性肉芽腫性改變，菌絲或孢子結構周圍可見高度嗜酸性物質沉積，又稱之為Splendore-Hoeppli現象[19-21]。

但僅僅依靠組織病理學檢查的方法，診斷毛霉病并不完全可靠，組織病理上不能明確區分曲霉與毛霉。針對組織病理進行免疫組化檢查[22，23]或利用PCR技術對石蠟包埋組織進行真菌核酸檢查[24-27]，都具有更高的特異性。

1.3.2 病原菌直接鏡檢及分離培養 直接鏡檢即取病變處分泌物在顯微鏡下直接鏡檢，可使用免疫熒光等快速染色方法，可盡快確認患者分泌物中是否有菌絲、孢子等真菌成分[28]。但直接真菌鏡檢的陽性率僅20%。

因此作為黃金診斷標準，病原菌的分離培養至關重要，對于后期指導用藥且針對治療不敏感的病原菌完善藥物敏感試驗具有決定性意義。且毛霉目真菌生長迅速，通過培養分離、鑒定菌種的方法相對并沒有明顯滯后性。初代培養通常選用沙氏瓊脂培養基，通常建議用新鮮的分泌物或相對完整組織進行培養；但不推薦研磨，因研磨可破壞菌絲結構，不利于真菌生長。毛霉目真菌適應性較強，室溫或37℃均可生長；菌落為棉花狀或絨毛狀，開始為白色，稍久呈現出暗色或灰黑色，頂端可見孢子囊顆粒。顯微鏡觀察可見特征性的假根、匍匐菌絲、孢子囊、囊軸、囊托、囊領、孢囊梗及孢子囊孢子等結構[29]。

1.3.3 病原菌的分子學鑒定 相對于形態學鑒定，分子學方法對于病原體種屬分類可信度更高。部分學者認為對于不同病原菌感染所導致的鼻腦型毛霉病而言，其疾病進展速度、預后情況、抗真菌方案的選擇都可能與種屬分類存在相關性[30-32]。如個案報道證實小克銀漢霉屬感染與預后不良相關，且有體外模型支持[33，34]；但目前仍缺乏關于鼻腦型毛霉病的病原菌種屬與疾病進展相關性的系統性研究報道。完善的種屬鑒定對于區域性的高危人群的發病預防及暴發流行應對都有很高的醫學價值，因此，分子學鑒定在鼻腦型毛霉病的診療中的地位與價值必須受到重視。

毛霉目中不同屬真菌鑒定及分類學研究進展不一，但目前內轉錄間隔區ITS序列及28S核糖體亞基序列，即可對毛霉目真菌進行很好的種屬鑒定[35]，種屬鑒定率可達98%以上，足以滿足臨床鑒定需要。近些年，隨著實驗室檢驗技術的發展，非傳統的種屬鑒定技術也逐漸開始應用，最具代表性為基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術(MALDI-TOF MS)，隨著該技術數據庫的完善，對于鼻腦型毛霉病的致病真菌準確的種屬鑒定率已經可達到95%以上，體現出了良好的應用前景[36，37]。此外，隨著第三代數字PCR技術的逐漸推廣，基于數字PCR技術的毛霉菌病的鑒定具有廣闊的應用和發展前景。現今，國內外對于部分真菌感染開展的三代PCR檢測技術已經體現出了高敏感性、高特異性的診斷價值[38，39]。但毛霉菌作為常見的實驗室污染菌，如何確保檢驗結果的可靠性，仍然需要實驗室人員及醫務工作者進行關注。

2 易感因素

20世紀中期，糖尿病逐漸成為鼻腦型毛霉病的主要危險因素。近年來，化療或免疫抑制劑的應用、潛在的惡性淋巴細胞腫瘤等也成為了毛霉病的重要危險因素[1，40，41]。如隨著實體器官和造血干細胞移植(HSCT)的開展，術后免疫抑制劑的大量使用，在這些患者群體中相關病例報道逐年增多[42]。隨著人們對真菌免疫研究的進一步深入，某些自身的基因缺陷被認為與毛霉病的發病密切相關，尤其以CARD9基因缺陷為代表。因此對于無相關危險因素的感染患者，考慮其是否具有先天性的基因缺陷十分有必要[43，44]。國內因缺少關于毛霉菌病的相關報道及多中心研究，因此尚未見到相關流行病學報告，但就目前為數不多的案例報道來看，免疫缺陷及糖尿病也為我國常見的易感因素[45-47]。

另外一種相對特殊類型的鼻腦型毛霉病，可發生在免疫力正常的人群，感染多由于外傷引起，引起鼻或顏面或周圍其他皮膚慢性感染，病史通常超過3個月，表現為慢性起病的局部浸潤性斑塊、結節、輕度破潰結痂、萎縮性瘢痕形成，緩慢外延。在患處手術或者其他因素的誘導下，引起深部組織暴露及病原體的深部播散，產生鼻竇等處的深部感染，從而呈現出慢性病程的鼻腦型毛霉菌病[48]。

3 發病機制

鼻腦型毛霉病的發病機制與病原菌自身特性及宿主均有密不可分的聯系。另外，部分菌株自身特殊的遺傳突變，對常規抗真菌藥產生抗性，也是造成部分病例進展迅速的重要原因。

3.1 首先，毛霉目真菌感染人體后，巨噬細胞的吞噬作用為人體第一道防線。但相關研究證實，毛霉目真菌孢子被巨噬細胞吞噬后可長期存在于巨噬細胞內，因此可以在感染第一環節就形成免疫逃避。相關動物及細胞模型證實，這種機制與毛霉目孢子細胞壁上的黑色素有關。這種黑色素對巨噬細胞中的亮氨酸氨基肽酶(LAP)與吞噬小體成熟產生抑制作用，同時可通過持續激活AKT/PI3K信號通路抑制巨噬細胞凋亡從而獲得持續的免疫逃避[49]。除此以外，相關研究證實，當未形成免疫逃避的孢子在患處萌發后可以迅速誘導募集以巨噬細胞為主的免疫細胞凋亡，因此進一步加快了毛霉病的進展速度[50]。

3.2 人體中存在的多種無機離子對于致病真菌的生長有促進作用，鐵離子作為最重要的離子之一，是真菌能量代謝氧化呼吸鏈中參與電子傳遞的鐵硫蛋白的氧化還原中心，豐富的鐵元素可以促進真菌繁殖。如糖尿病患者因體內酸中毒或鐵利用障礙等疾病，血清轉鐵蛋白與游離鐵的結合能力降低，游離鐵離子升高，進而促進真菌的繁殖[51,52]。以鼻腦型毛霉病最常見的病原菌根霉屬真菌為例，當孢子與免疫細胞共同孵育時，其與鐵利用相關的基因表達上調，尤其以Fet3和Ftr1為主；Fet3是一種吸收亞鐵所需的多銅亞鐵氧化酶，它與高親和力鐵滲透酶Ftr1相互結合、相互作用在孢子的鐵同化途徑中發揮重要作用。同時在模型中也證實，與正常巨噬細胞相比，病原菌感染的巨噬細胞，其與鐵轉運及分布相關的基因(heph、fxn、bdh2、hfe、ltf、lcn2、steap1、steap2和steap4)表達兩者間存在差異。這證實了鐵元素在毛霉病中扮演的重要角色，也為針對毛霉病的螯合鐵治療提供強有利的理論支持[49]。部分菌株因存在細胞壁鐵結合受體Fob1和Fob2蛋白基因缺陷，導致無法正常利用鐵元素，可抑制真菌的生長，因此抑制或拮抗鐵結合受體蛋白的表達可能為鼻腦型毛霉病或其他類型毛霉病的治療提供新方法[53]。

3.3 從病原菌的生物學角度來看，毛霉目為多能量來源真菌，在感染中，毛霉目真菌可以利用患者體內豐富的葡萄糖、酮體進行能量代謝，因此糖尿病患者且存在酮癥酸中毒為感染高危人群[54]。

3.4 感染宿主個體因其血糖濃度升高和血清pH值降低，削弱了中性粒細胞對菌絲的趨化性和黏附性，高濃度葡萄糖也增加了GRP78(內皮細胞葡萄糖調節蛋白78，作為毛霉目真菌黏附受體)在內皮細胞中的表達，幫助病原菌附著和通過血管入侵[55,56]。

3.5 免疫功能低下患者則由于原發性疾病造成的免疫細胞數量減少或功能異常，無法及時識別和吞噬并殺滅真菌，造成真菌感染的擴散[57]

3.6 在低氧環境下毛霉目真菌需氧的能量代謝通路相關基因表達下調，利用脂質的無氧代謝通路基因表達上調，表明毛霉目真菌較其他種屬真菌具有更強的耐低氧繁殖及侵襲性感染能力[58]。

3.7 另外，病原菌自身的毒力及特殊的遺傳突變也是其致病機制不可忽視的重要部分。吸入的毛霉目孢子進一步侵襲性感染首先需要孢子萌發[59,60]。孢子越大萌發越快，且具有更強的毒性[61]。研究發現，孢子大小和鈣調神經磷酸酶，均與毛霉目真菌的毒力相關，在毛霉病動物模型中，較大的孢子毒力更強；而鈣調神經磷酸酶A催化亞基CNAA的缺失會導致更大的產孢量和更強的毒力表型。同時，G蛋白信號級聯在許多病原真菌的毒力中起著至關重要的作用，當編碼G蛋白α亞基的Gpa11和Gpa12基因功能降低，則會產生更大體積的孢子[62,63]。在最近的關于毛霉菌的抗藥研究顯示，當部分病原菌接觸到抗真菌藥物時，它們會激活一條基于RNAi(RNA干擾)的途徑，迅速產生耐藥突變菌株。特異性阻斷mRNA降解途徑的突變，如基因r3b2和rdrp3中的突變，增加了耐藥表型的產生，類似于rdrp1突變的表型。相反，抑制誘導蛋白(QIP)和類SAD-3解旋酶(RNHA)相關的突變阻止了耐藥表觀突變體的形成[64]。

4 小結

鼻腦型毛霉菌病是毛霉目真菌造成的侵襲性真菌感染，進展快速，若診斷治療不及時死亡率極高。鼻腦型毛霉病的病原學研究及相關發病機制的研究在本病的診療中有十分重要的價值。病原菌的病理學檢查、真菌學檢驗及分子鑒定對于診斷和治療有著非同尋常的意義。因毛霉目真菌為實驗室常見污染菌，如何快速區分污染還是致病菌仍然是實驗室和醫務工作所面對的巨大挑戰。另外區域致病菌種的進一步鑒定，致病菌種與其毒力差異研究可能為降低毛霉病，尤其是鼻腦型毛霉病的死亡率提供幫助。