PCR 快速檢測食品中牛源性成分

肖明雅，馮娜娜，陳 陽，尹 銳

（吉林農業科技學院生物與制藥工程學院 132101）

1 引言

食品中動物物種成分的正確標注，可提升食品安全、食品質量，增強消費者的消費信心、維護商業公平，保障食品行業的健康發展。 當今社會，食品生產、加工和流通鏈條較長，使得食品摻假的機會明顯增多。 一些不法商家為了謀取暴利，將價格較低的肉摻入價格較高的肉制品中出售[1]，如以雞肉冒充豬肉，豬肉冒充牛羊肉[2]。 更為嚴重的是近幾年頻頻曝出了“利用老鼠、狐貍、水貂肉添加明膠、胭脂紅等冒充牛肉”[3]等。 因此，建立一種準確、快速、靈敏的食品中牛源性檢測技術勢在必行。

基于蛋白質[4-6]和基于DNA 技術[7-12]的檢測是動物物種鑒定的主流方法。 蛋白質檢測方法簡單易行，但是食物中的蛋白質經深加工和熱處理易發生變性而無法檢出。與蛋白質相比，DNA 具有較高的熱穩定性和物種特異性， 可對不同深加工方式的食物中的物種成分有效檢出[13,14]。 因此，越來越多的檢測手段開始著眼于DNA 水平檢測的研究。

PCR 法和實時熒光定量PCR 技術由于檢測快速、 靈敏性高、特異性好等優勢，被更多的用于動物物種的檢測研究[15-20]。 根據PCR 檢測基本原理，本研究對待測引物及探針進行獨特設計，以牛源性成分的快速檢測為切入點， 建立了一種食品中牛源性成分PCR 快速檢測方法。 該方法具有快速、靈敏度高、特異性強[21,22]等優點，以期成為一種新型的物種成分快速分子檢測工具，在牛源性成分檢測、摻假鑒定及物種溯源過程發揮重要作用。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

2.1.1 材料與試劑

瓊脂糖、DNA 分子量標準Marker A（25～500bp）、磁珠法動物基因組DNA 提取試劑盒、PCR 預混液 （上海生工生物工程股份有限公司）。

實驗樣本于長春某大型超市選購，包括牛肉、羊肉、雞肉、豬肉、鴨肉、魚肉及28 份商業樣品。

2.1.2 主要儀器設備

TG16KR 臺式高速冷凍離心機 （上海繼譜電子科技有限公司）；PCR-MGL96+普通PCR 儀（日本島津公司）；SCANDRPO 100超微量核酸蛋白測定儀 （德國耶拿分析儀器股份公司）；E-Gel Imager 核酸凝膠成像系統（賽默飛世爾科技有限公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 樣品DNA 提取及純度檢測

將每個肉的樣品切碎并精確稱重； 每個樣品按動物基因組DNA 提取試劑盒提取0.1g， 然后根據試劑盒說明書步驟進行樣本DNA 的提取。 DNA 樣品的完整性用1%瓊脂糖凝膠電泳法鑒定； 樣品的純度用超微量核酸蛋白測定儀在OD260/OD280 處的吸光度值來確定，數值在1.7～1.9 的可用于PCR 反應。

2.2.2 引物的設計

從國家生物技術信息中心 （national center for biotechnology information，NCBI) 網站下載牛和其他動物物種的線粒體DNA 序列。 物種線粒體基因組Genbank 號如下：

Bos taurus (GU947021，AY126697，FJ997262，KR011113，NC_036020)，Equus caballus (AP013085，AY584828，KT368757)，Equus asinus (MK982180)，Ovis aries (KU575248，KF312238，KX609626)，Capra hircus (MK234706，MH229952)，Sus scrofa(KY964306，MK251046，GU147934，MK248682)，Canis lupus familiaris (CM016608，KT591870，EU408280)，Gallus gallus (KX987152，GU261718)，Pandalus borealis (FJ403244)，Austruca lactea (NC_042401)，Parasesarma affine(NC_039990)，Anas platyrhynchos (MF069251，EU755252）。 對這些序列通過Vector NTI Advance11.0 進行分析(Ink/Thermo Fisher Scientific Carsbad，CA，USA)，進行多序列比對，選用跨牛線粒體基因組的ND5-ND6基因（煙酰胺嘌呤二核苷酸（nicotinamide dinucleotide，NADH）脫氫酶亞基5 和NADH 脫氫酶亞基6 編碼基因） 設計引物。 使用DNAStar 軟件對候選引物的物理參數進行評估。 使用BLAST 工具(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)對引物的特異性進行驗證。 引物由生工（上海）生物工程有限公司合成。 序列如表1。

表1 引物序列

2.2.3 PCR 擴增及電泳檢測

PCR 反應體系25μL 包含5.2μL PCRMIX、 上下游引物各0.8μL(10μmol/L)、1μL 的DNA 模板和17.2μL 的ddH2O。 PCR反應條件：95℃預變 性5min，95℃變 性30sec；56℃退火30sec；72℃延伸30sec，40 個循環。 取5μL PCR 擴增產物用于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 電泳條件為電壓100V，電流80mA；30min 后凝膠成像儀分析結果。

2.2.4 檢測的特異性

提取牛肉、羊肉、雞肉、豬肉、鴨肉、魚肉基因組DNA，以ddH2O 為陰性對照。應用牛源性成分特異引物進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，實驗重復3 次。 驗證反應的特異性。

2.2.5 檢測的靈敏度

研究采用瓊脂糖凝膠電泳評價PCR 檢測技術的靈敏度。將純化的牛基因組DNA 進行梯度稀釋， 呈1ng，100pg，10pg，1pg，100fg，10fg 和1fg 7 個濃度， 分別以各濃度的DNA 作為模板進行PCR 擴增； 通過瓊脂糖凝膠電泳來確定該檢測的靈敏度。 上述實驗重復3 次。 驗證檢測的靈敏度。

2.2.6 實際樣品的檢測

從超市購買標明成分的25 份牛肉及豬肉制品，按2.2.1 方法提取其基因組DNA，通過牛源性PCR-電泳檢測以評價其在實際樣本檢測中的適用性。

3 結果與分析

3.1 檢測的特異性

分別提取牛、羊、豬、雞、鴨、魚的基因組DNA，各DNA 樣本均稀釋至10ng/μL，通過牛源性成分特異性引物進行PCR 擴增；通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。 結果表明該方法對牛DNA 特異性檢出，其他物種無交叉反應。 如圖1。

圖1 牛源性PCR-凝膠電泳特異性檢測結果

3.2 檢測的靈敏度

本研究采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR 檢測方法的靈敏度進行了評價。 首先，通過PCR-凝膠電泳對10 倍梯度稀釋牛DNA進行檢測，其最低檢測限達到10pg (圖2）。 因此，本研究建立的PCR 檢測方法的可以檢測10pg 以上的牛源性DNA 成分。

圖2 牛源性PCR-凝膠電泳檢測法的敏感度

3.3 商業樣品的檢測

提取25 份牛肉及豬肉待測樣品DNA， 通過牛源性成分PCR-電泳檢測，每個樣品做了一個平行樣。 所有的牛肉制品檢測結果均為陽性，對豬肉樣本檢測均呈陰性，如表2。 因此，該方法可以用于商業樣本中牛源性DNA 的檢測。

4 結論

本研究跨牛線粒體基因組ND5-ND6 基因設計引物，建立了一種食品中牛源性成分快速檢測方法。 該技術有望成為一種新型的物種成分快速分子檢測工具，在牛源性成分檢測、摻假鑒定及物種溯源過程發揮重要作用。