普洱茶醇提物對非酒精性脂肪性肝病小鼠的肝保護作用研究*

賈 璐，柯 旺，李 襄，邢 玥，徐 梅，楊 雋，趙 榮，欒云鵬△

（1.西南林業大學生命科學學院，云南 昆明 650224；2.云南中醫藥大學第一附屬醫院， 云南 昆明 650021）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種非酒精所致的，以肝臟中脂類所占比重過高及肝臟細胞脂肪變性為特征的臨床綜合征[1]。NAFLD是導致慢性肝臟疾病的主要原因。近年來隨著相關代謝綜合征和肥胖癥在全球大范圍流行，NAFLD的發病率也逐步升高且患者日漸年輕化，已成為我國較為普遍的疾病[2-3]。目前已知有多種原因可引發NAFLD，臨床上最常見的原因是肥胖，約50%～75%的肥胖患者合并有不同程度的NAFLD，因此調節脂質代謝正常化對治療NAFLD有積極意義。普洱茶是一類深受大眾歡迎的保健茶，其浸出物包含茶堿、咖啡堿、茶多酚以及維生素等多種生理活性物質。近年來，普洱茶在解毒、降血脂、抑菌等方面有較多的應用研究[4-5]。本試驗以高脂飲食誘導的NAFLD小鼠模型為基礎，探討普洱茶醇提物在改善脂質代謝紊亂及肝臟病理損傷中的效用，為開發安全有效的NAFLD干預保護及輔助治療藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡ICR小鼠50只，雄性，平均體質量（24.87±2.91）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產批次：SCXK（湘）2016-0002。小鼠在空調動物飼養室中同室群籠飼養，室溫（22±2）℃，濕度40%～70%，自然光照，每日定時通風。自由采食和飲水，每日更換墊料、鼠籠并洗滌飲水瓶。

1.2 藥物與試劑 基礎鼠糧（江蘇美迪森生物醫藥有限公司）；全脂奶粉（內蒙古伊利實業集團股份有限公司）；魚肝油乳（國藥控股星鯊制藥廈門有限公司）。普洱茶（熟茶）（中國普洱茶研究院，編號：532721-616）；無水乙醇、石油醚、正丁醇、多聚甲醛（天津市致遠化學試劑有限公司，AR）；苦味酸（臺山市眾城化工有限公司，AR）；TG、TC、AST、ALT 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；HE染色試劑盒（上海榕柏生物技術有限公司）。

1.3 儀器 SW-CJ-2FD潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；搖擺式高速中藥粉碎機（中國浙江溫嶺市林大機械有限公司）；TU-1901紫外/可見分光光度儀（上海菁華科技儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（德國IKA集團）；DMi1倒置顯微鏡（德國徠卡公司）；101-1AB電熱恒溫鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 高脂鼠糧制備 每100 g基礎鼠糧加入豬油50 g，雞蛋液 60 g，全脂奶粉 20 g，魚肝油 50 g，食鹽1 g，混勻攪拌成糊狀，捏制成直徑不超過5 cm的圓餅，放入微波爐大火烤5 min后翻面再烤5 min即得。

1.4.2 普洱茶膏的制備 普洱茶（熟茶）購自中國普洱茶研究院。茶樣打磨成粉，過80目篩，取100 g茶粉與1 000 mL 95%乙醇混合進行抽提，重復3次后進行旋轉蒸發，再冷凍干燥至恒重后即得固態膠狀茶膏，保存于4℃，使用時以蒸餾水溶解茶膏得水溶劑，灌胃。

1.4.3 動物分組及給藥 50只健康ICR小鼠適應性飼養1周后隨機抽取10只作為空白對照，剩余40只用于構建NAFLD小鼠模型。在建模期間，空白對照組飼喂基礎鼠糧，建模組飼喂高脂鼠糧，每隔1周記錄小鼠體質量，持續至第19周。通過體質量變化及生理行為觀測確認建模成功后，將40只NAFLD小鼠隨機分為：模型組10只、高劑量治療組15只、低劑量治療組15只，對高、低劑量組進行為期6周的普洱茶干預治療。治療期間所有ICR小鼠均飼喂基礎鼠糧，自由飲水；高、低劑量組額外增加普洱茶醇提物灌胃治療。根據多項普洱茶提取物經口毒性試驗結果，受試個體最保守 LD50為＞5.0 g/kg·bw[6-7]，設置高劑量為5.0 g/kg·bw，低劑量為 2.0 g/kg·bw，每日灌胃 1 次。

1.4.4 指標檢測 每天進行生理行為觀察，每周測量1次體質量。治療期結束后采用頸椎脫臼法處死小鼠。通過眼眶靜脈叢釆集全血，分離血清，測定血清中甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesteral，TC）、谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）的含量；取肝臟經液氮研磨后的上清液，測定肝臟中TG、TC、AST、ALT的含量。分離腹腔脂肪、腎周脂肪以及睪丸周圍脂肪稱重，計算體脂肪（體脂肪總量=腹腔脂肪+腎周脂肪+睪周脂肪）[8-9]。取小鼠肝臟稱重，計算肝臟指數（肝臟指數=解剖時提取的肝臟濕重/斷水斷糧12 h后小鼠體質量×100%）。取部分肝臟置于4%多聚甲醛溶液中固定，經醇脫水、透明、石蠟包埋后制成切片，HE染色后進行組織學觀察。

1.5 統計學分析 使用SPSS 22.0軟件包對實驗數據進行統計學處理，數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析法處理。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠體質量變化 實驗初始，空白組與NAFLD建模小鼠采用隨機分組方式，初始體質量（25.01±2.89）g、（24.57±2.67）g，組間體質量無差異。高脂鼠糧飼喂19周，NAFLD建模組小鼠明顯表現出慵懶、行動緩慢、精神萎靡的癥狀，且毛發有油膩感，進食減少，體質量遠高于空白對照組小鼠（P＜0.05），提示造模成功。建模完成后，治療期起始（記為0周），連續灌胃6周，模型組、高劑量組、低劑量組小鼠體質量均高于正常組，但組間無統計學差異（P＞0.05）。普洱茶灌胃治療期間，與模型組相比，高、低劑量治療組平均體質量降低（P＜0.05），其中高劑量組體質量基本達到空白對照組水平，精神狀態也有所恢復。以上結果表明，普洱茶醇提物能有效降低高脂飲食導致的體質量增加，并改善由此引發的異常行為表現，見表1。

表1 普洱茶對小鼠體質量的影響（±s，g）

表1 普洱茶對小鼠體質量的影響（±s，g）

注：與同期空白組比較，*P＜0.05；與同期模型組比較，△P＜0.05。

組別 N/支 0周 1周 2周 3周 4周 5周 6周空白組 10 39.15±3.79 40.12±3.50 40.67±3.84 41.25±3.28 41.83±3.11 42.21±2.78 42.61±3.04模型組 10 45.43±2.23* 46.21±2.78* 45.53±3.31* 45.72±2.95* 46.34±3.02* 46.58±2.46* 47.13±2.35*高劑量組 15 45.54±2.57* 45.43±3.56* 44.21±3.98*△ 44.52±3.78*△ 43.71±4.06△ 43.31±3.31△ 42.71±2.94△低劑量組 15 45.47±2.93* 45.44±3.12* 44.71±2.96*△ 44.84±3.18*△ 44.51±3.20*△ 43.71±3.59△ 43.52±3.16△

2.2 臟器及血清脂質含量變化 肝臟指數能在一定程度上反映肝臟的病理學改變。與空白組比較，模型組小鼠的肝臟指數顯著增高（P＜0.05）。經過普洱茶醇提物治療后，治療組小鼠肝臟指數較模型組明顯降低（P＜0.05），并呈現出一定的劑量趨勢。治療組小鼠體內儲存性脂肪與模型組相比明顯減少（P＜0.05），表現為腹腔及睪周脂肪含量雖仍高于空白組小鼠，相較于模型組同一部位的脂肪含量下降顯著（P＜0.05）。以上結果表明，普洱茶能在一定程度上降低NAFLD小鼠體內脂肪組織沉積，在控制肥胖引起的肝臟重量增加方面效果更為明顯，表現出良好的肝臟保護作用，見表2。

表2 普洱茶對NAFLD小鼠肝臟指數及體脂含量的影響（±s）

表2 普洱茶對NAFLD小鼠肝臟指數及體脂含量的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別 N/支 肝臟指數/% 腹腔脂肪/g 腎周脂肪/g 睪周脂肪/g 體脂肪總量/g空白組 10 3.32±0.13 0.12±0.04 0.21±0.12 0.19±0.08 0.52±0.15模型組 10 5.05±0.21* 0.18±0.04* 0.28±0.14* 0.71±0.21* 1.17±0.26*高劑量組 15 4.10±0.06△ 0.16±0.02△ 0.27±0.10 0.54±0.11△ 0.96±0.13△低劑量組 15 4.68±0.16△ 0.17±0.05△ 0.27±0.12 0.53±0.14△ 0.97±0.19△

甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）水平能進一步反映體內脂肪代謝的紊亂程度。與空白組相比，模型組小鼠肝臟組織和血清中TG、TC的含量明顯升高（P＜0.05）。經普洱茶醇提物治療后，高、低劑量組小鼠的肝臟與血清中TC、TG水平較模型組明顯下降，并呈現出一定的劑量趨勢（P＜0.05），表明普洱茶能夠發揮調節脂質代謝、降低血清和肝臟中脂肪含量的作用，見表3。

表3 普洱茶對NAFLD小鼠肝臟與血清中TC、TG的影響（±s）

表3 普洱茶對NAFLD小鼠肝臟與血清中TC、TG的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別N/支肝TC/（mmol·L-1）肝TG/（mmol·L-1）血TC/（mmol·L-1）血TG/（mmol·L-1）空白組 10 1.51±0.06 0.71±0.12 1.10±0.08 1.24±0.09模型組 10 3.22±0.07* 2.12±0.16* 2.31±0.12* 2.98±0.21*高劑量組 15 2.14±0.12△ 1.02±0.03△ 1.33±0.17△ 1.96±0.08△低劑量組 15 2.70±0.09△ 1.72±0.11△ 1.63±0.15△ 2.25±0.16△

2.3 轉氨酶ALT、AST活性 肝臟中富含各種轉氨酶，其中ALT、AST是臨床上常用的檢測肝細胞受損程度的指標。與空白組比較，模型組小鼠肝臟和血清中AST、ALT的活性明顯升高（P<0.05），提示肝細胞受損。經普洱茶醇提物治療后，治療組的AST、ALT水平都明顯下降（P<0.05），且存在劑量依賴性。可見普洱茶醇提物在緩解肝細胞受損、降低轉氨酶方面療效顯著。

表4 普洱茶對NAFLD小鼠肝臟與血清中ALT、AST的影響（±s）

表4 普洱茶對NAFLD小鼠肝臟與血清中ALT、AST的影響（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別N/支肝ALT/（U·L-1）肝AST/（U·L-1）血ALT/（U·L-1）血AST/（U·L-1）空白組 10 47.30±3.23 21.00±3.98 92.85±4.99 49.35±6.59模型組 10 96.86±4.21* 52.71±2.25* 176.18±5.34* 77.16±2.26*高劑量組 15 60.69±4.65△ 29.56±1.32△ 118.45±6.47△ 55.95±6.55△低劑量組 15 82.91±3.87△ 43.18±2.51△ 143.98±3.56△ 64.84±6.54△

2.4 肝臟組織病理學觀察 各組小鼠的肝臟切片經HE染色后置于低倍鏡下觀察，空白組肝臟組織小葉結構正常，肝細胞胞質豐富，染色均勻，細胞核明顯，未見明顯異常。NAFLD模型組中可見肝細胞腫脹，多數細胞內存在彌漫性脂肪空泡，并可融合成細胞內大的脂滴。這表明高脂鼠糧飼喂方式成功構建了NAFLD小鼠模型，且在不經藥物處理，換喂基礎鼠糧6周后，肝臟脂肪沉積狀況并無改善。經普洱茶醇提物治療后，不同劑量治療組的肝臟病理情況明顯改善，高劑量組肝臟雖還有許多脂肪空泡，但數量和大小較模型組已顯著減少；低劑量組的改善效果較模型組不夠明顯。表明普洱茶醇提物對NAFLD肝臟細胞的脂肪變性具有較好的改善作用，且治療恢復能力與劑量相關，見圖1。

圖1 肝臟組織HE染色（×200）

3 討論

NAFLD是肥胖和代謝綜合征（metabolic syndrome，MetS）累及肝臟的表現，治療單純性脂肪肝階段的首要目標是減肥和改善胰島素抵抗（insulin resistance，IR），預防和治療 MetS、Ⅱ型糖尿病（T2DM）及其相關并發癥，從而減輕疾病負擔、改善患者生活質量并延長壽命[10]。在減肥方面，普洱茶作為一種傳統降脂減肥茶備受歡迎。徐湘婷等[11-12]發現普洱茶湯能較好地抑制高脂模型動物的體質量與血脂，減輕高脂飼料誘發的大鼠肝臟脂肪變性程度，并且可能與抗氧化相關的超氧化物歧化酶SOD和GSH-PX活性有關，認為普洱茶可能通過抗脂質過氧化來調節血脂紊亂。熊昌云[13]探討了普洱茶乙酸乙酯萃取層及水層分離物對小鼠體內脂肪代謝相關酶活性的影響，發現前者呈劑量效應降低小鼠體內肝脂肪酸合成酶活性及血清瘦素含量，并且二者在一定程度上抑制3T3-L1前脂肪細胞的活力和增殖，同時促進成熟脂肪細胞的脂解，減少其數量和體積，從而減少甘油三酯的整體含量。研究認為普洱茶主要通過茶褐素、茶多糖、茶多酚及發酵過程中微生物產生的他汀類物質直接影響食物攝入、吸收，抑制脂肪合成、加快脂肪分解，從而達到減肥降脂的效果[14]。Huan等[15]深入探討了普洱茶中的茶褐素通過腸道菌群和膽汁酸代謝改善高膽固醇血癥的機制，提示了腸道菌群在脂代謝中的重要作用。

本研究通過飼喂高脂飼料構建了NAFLD小鼠模型，建模成功后采用普洱茶醇提物進行灌胃治療，各治療組的肝臟指數、肝臟脂質和主要血脂指標與模型組相比都明顯降低，證實普洱茶醇提物在降脂減肥方面有顯著功效。相比水提物，普洱茶醇提物中主要含茶多酚、兒茶素類及沒食子酸等，茶褐素、可溶性糖及可溶性蛋白等含量則明顯偏低，提示普洱茶醇提物與水提物的降脂減肥機制可能存在差異[11]。針對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等的體外研究表明，普洱茶醇提物的抑菌效果顯著，且95%醇提物抑菌效果強于水提物及75%醇提物[16-17]。由此我們推測普洱茶醇提物可能對實驗小鼠的腸道菌群結構也產生了一定影響，進而影響到脂代謝的調節，對于該假設的驗證實驗還需進一步開展。

臨床研究發現NAFLD患者肝臟和血清中ALT、AST的水平與正常個體存在差異，中度NAFLD患者的肝臟AST、ALT出現輕度或中度升高，而重度NAFLD會引起AST、ALT顯著增高[18]。此外，當NAFLD由單純性脂肪肝向非酒精性脂肪性肝炎（nonalco holic steatohepatitis，NASH）發展過程中，也伴隨AST、ALT含量的明顯上升，而NASH被認為是NAFLD進展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌的分水嶺[19-20]，可見ALT、AST的含量是評估NAFLD的重要指標。本研究構建的NAFLD模型小鼠肝臟及血液中ALT、AST的含量遠高于空白組，經過6周的普洱茶醇提物治療后，二者含量均明顯降低，表明普洱茶具有修復受損肝細胞并阻止NAFLD進一步向肝纖維化發展的功效。此外，治療組小鼠腹腔、腎周及睪周脂肪量降低有限，高、低劑量治療效果差異也不明顯，而肝臟指數和肝臟脂質得到顯著改善且與劑量相關，推測普洱茶醇提物在改善肝臟脂肪代謝方面更有優勢，其具體作用機制有待深入研究。

雖然治療組小鼠的各項指標較模型組有明顯改善，但部分指標仍與空白組存在一定差距。例如治療組小鼠僅體質量基本恢復到空白組水平，體脂、血脂、ALT、AST的含量雖呈下降趨勢，仍高于正常組，可能與普洱茶醇提物成分或作用較為單一以及用藥周期較短有關，另一方面也顯示出干預和治療NAFLD的復雜性。