高壓干熱處理對紫蘇粉的滅菌作用和促成分溶出作用*

咩咩此里，阿 茸，李 月，殷 華，段金連，段為鋼△

（1.云南中醫藥大學云南省中醫藥學分子生物學重點實驗室，云南 昆明 650500；2.迪慶州藏醫醫院制劑室，云南 香格里拉 674400）

熱處理是制藥和食品工藝中常見操作，多用于滅菌和炮制[1-9]。物品消毒滅菌的方法很多，總體上分為物理法和化學法。制藥工藝常采用物理法進行消毒滅菌。對于制劑成品，可靠的消毒滅菌方式是高壓濕熱滅菌和輻照滅菌[1]。輻照滅菌所需的硬件設施要求較高，一般建立在較發達城市，不方便較偏遠的制藥企業或醫院使用。高壓濕熱滅菌對硬件設施要求較低，滅菌也很徹底，但滅菌過程涉及到水蒸氣加熱，可能會使滅菌物潮化，繼而需要烘干等操作，不適用于不耐濕物料。干熱滅菌可以避免滅菌物潮化的問題，但目前采用的都是常壓干熱處理[4，7]，因溫度高（135℃以上）、時間長（180～200℃要0.5～1 h，135～140℃要3～5 h），滅菌后物料失重明顯，對物料的性狀影響較大，在制藥工藝鮮有應用。

本研究試圖結合高壓濕熱滅菌和常壓干熱滅菌的優點，開發一種高壓干熱滅菌技術，在檢驗滅菌效果的同時也考察其對中藥材（粉末）溶出的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 中藥紫蘇 （Perilla frutescens（L.）Brltt.var.arguta Benth.Hand.-Mazz.）為野生，產自湖南，經云南中醫藥大學藥用植物學教研室鑒定。全自動高壓蒸汽滅菌器和干熱滅菌器為日本天美產品，透紫外平底96孔板為Greiner產品，Tecan多功能酶標儀（Infinity 200pro）為奧地利產品。

1.2 藥材加熱處理 將紫蘇梗干燥粉碎過40目篩。精密稱取17份0.4 g紫蘇粉分別裝于容積為15 mL的帶蓋耐壓塑料試管中。其中一管為對照，不進行加熱處理（標記為加熱0 min）；其余以4管為一組，共4組。第1組開蓋置于高壓蒸汽滅菌器中（高壓濕熱），第2組蓋緊后置于高壓蒸汽滅菌器中（高壓干熱），第3組蓋緊置于干熱滅菌器中（常壓密閉干熱），第4組開蓋置于干熱滅菌器中（常壓開放干熱），分別于 110 ℃（0.143 MPa）加熱 15、30、60、120 min。加熱時間以達到溫度開始計算，熱處理完畢自然降溫到60℃后擰緊試管蓋取出恢復至室溫。精密稱量滅菌前后藥粉的重量變化。

另取17份0.4 g紫蘇粉如法在 121℃（0.204 MPa）進行加熱。以上實驗各重復3次。

1.3 藥材無菌檢查 在各試管內加入5 mL無菌蒸餾水，蓋緊蓋子平放于旋轉搖床上100 r/min振搖6 h。于4℃靜置2 h以上，取上清0.5 mL在無菌操作條件下涂布于滅菌LB瓊脂平板（蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂10 g，121℃高壓滅菌30 min后制得）上，于37℃培養過夜。觀察LB固體培養基上的菌落生長情況，拍照記錄。

1.4 藥材溶出物檢查 將試管于3 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL加入到透紫外的96孔板中，用酶標儀掃描230～800 nm吸收曲線，2 nm步進。如果波長范圍內最大吸收值超過2，加水稀釋1倍再掃描，記錄稀釋倍數。在扣除同等體積無菌水背景后，將OD值乘以稀釋倍數得到原液的原始吸收值。按照文獻方法求出等吸光點[10]，計算等吸光點前的吸收光譜曲線下面積以反映藥材的溶出物。

2 結果

2.1 紫蘇粉末高壓干熱前后的重量變化 高壓濕熱處理會導致中藥粉末吸潮，重量增加；而高壓干熱和常壓閉蓋處理藥粉的重量變化相對不明顯；常壓開蓋處理則藥粉的重量減輕最明顯。與110℃處理（圖1A）相比，121℃處理（圖1B）會進一步加劇重量變化，見圖1。

圖1 紫蘇粉110℃（0.143 MPa）熱處理（A）和121℃（0.204 MPa）熱處理（B）后的重量差異變化

2.2 高壓干熱處理對藥材微生物的影響 熱處理能抑制甚至殺滅微生物。未被熱處理的紫蘇粉浸出液上清（0 min）能培養出大量的細菌（圖2A、圖3A）；110℃高壓濕熱處理15 min及以上不能培養出細菌菌落（圖2A）；高壓干熱處理15 min可培養出個別菌落（圖2B），但處理30 min以上就不能培養出菌落；而常壓熱處理（圖2C、圖2D）滅菌效果較差。121℃熱處理的滅菌效果進一步增強，但常壓15 min處理（圖3C、圖3D）的樣品仍有個別菌落被檢出。以上結果說明，在相同溫度下，高壓處理（圖3A、圖3B）效果總體上優于常壓處理（圖3C、圖3D），見圖 2、圖 3。

圖2 110℃（0.143 MPa）不同方式熱處理的滅菌效果

圖3 121℃（0.204 MPa）不同方式熱處理的滅菌效果

2.3 高壓干熱處理對藥材成分溶出的影響 不同方式熱處理后溶出物的吸收光譜參見圖4、圖5。紫蘇粉溶出物在370 nm處存在等吸光點，等吸光點前的紫外區（230～370 nm）吸收值（圖6）能在一定程度總體反映藥物分子的溶出情況。

圖4 110℃（0.143 MPa）對紫蘇粉成分溶出的影響（吸收曲線）

圖5 121℃（0.204 MPa）對紫蘇粉成分溶出的影響（吸收曲線）

圖6 110 ℃（0.143 MPa）（A）和 121 ℃（0.204 MPa）（B）不同方式對藥材小分子成分溶出的影響（吸收曲線下面積230～370 nm）

高壓110℃熱處理（圖4A、圖4B）藥材粉末15 min即可增加溶出物的紫外吸收，以高壓干熱方式（圖4B、圖6A）增加較明顯。此溫度下常壓熱處理15 min則幾乎無效，延長熱處理時間則可增加溶出物的紫外區吸收（圖4C、圖4D）。

當進行121℃熱處理時，各種加熱方式均能增加溶出物紫外區的吸收（圖5），但常壓加熱（圖5C、圖5D）的紫外最大吸收值低于高壓加熱（圖5A、圖5B）的吸收值。特別地，高壓干熱處理（圖5B）15 min增加吸收值的能力即處在最大水平（圖6B）。

3 討論

由于缺乏高壓干熱處理裝置，本文將樣品置于密閉的試管內進行濕熱處理實現近似的高壓干熱處理操作。從以上結果看，在同等溫度和同等加熱時間，高壓濕熱處理的滅菌效果最好，其次即為高壓干熱處理，而常壓熱處理的滅菌效果較差。因此，考慮到處理后不需要干燥的優勢，高壓干熱處理仍是值得推薦的。理論上，高壓干熱處理后的樣品不應該存在重量差異，本研究也證實高壓干熱處理的樣品重量變化最小。如果要進行滅菌操作，121℃ 15～30 min、110℃30～60 min的高壓干熱處理是值得推薦的。

紫蘇含有揮發油成分和黃酮類等固體物成分[11]，本研究還用該藥材粉末模擬熱處理對中藥成分溶出的影響。根據前期中藥注射劑的研究結果，發現大多中藥的“活性成分”均具有較明顯紫外吸收[10，12]，甚至等吸光點前的吸收曲線下面積能綜合反映活性成分的多少，因此本文采用該特性“綜合”考察了熱處理對中藥成分的溶出影響。未被熱處理的中藥溶出物紫外吸收值較小，而熱處理后的中藥溶出物紫外吸收明顯增加，甚至還依次在290 nm和330 nm出現了明顯的吸收峰；這表明熱處理有助于藥材成分的溶出，這可能與熱處理改變了植物細胞膜或細胞壁結構有關。考慮到高壓干熱處理對藥材總體的重量影響較小，推測對藥材的性狀影響也較小。對于中藥紫蘇粉末而言，110℃15 min似乎就取得了較好的促藥材成分溶出作用，同時大大地降低了藥材的微生物載量，但對其他藥材的影響如何，仍需進行試驗。不管怎樣，該法在某些物料的處理中值得試用。

從機理上看，高壓熱處理阻止了熱量向外界擴散，有利于熱量在加熱體系內傳遞，從而有利于生物大分子物質發生變性、有利于殺菌、凝固藥材細胞并有利于活性成分釋放。高壓干熱處理的傳熱介質是空氣，高壓濕熱處理的傳熱介質是水蒸氣。由于水蒸氣存在汽化熱，在熱傳遞方面更加充分，因此高壓干熱處理的滅菌效果會略低于高壓濕熱滅菌。相反，常壓加熱，氣體會膨脹擴散到外界，熱量散失多而不利于熱量進入物體中，滅菌的效果會下降。

高壓濕熱和常壓干熱法在食品和藥品滅菌工藝中有著較廣泛的應用[1]，也取得一定效果。但高壓干熱法卻罕見報道，本研究為物料的滅菌和中藥炮制提供了一種選擇。將藥材加熱121℃30 min或110℃30 min可能在增加溶出的同時會導致藥材成分變化?？紤]到水是化學反應的重要介質，因此可以肯定的是，該方法所致的藥物成分影響會弱于高壓濕熱滅菌?？紤]到該條件在藥物炮制過程中并不算劇烈，該方法也可以供中藥炮制參考。然而，更為緊要的是要研制此類設備，以滿足醫院和制藥企業的需求。