細菌感染及其分型與兒童過敏性紫癜的相關(guān)性分析

朱由瑾，溫麗英，楊曉靜，馮冬梅，蘇 華，周向昭，安國芝

（1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院皮膚科，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗科）

過敏性紫癜是又稱亨特一許蘭綜合征（henoch.schonlein purpura，HSP），是兒童常見的由多種原因?qū)е碌姆茄“鍦p少性的出血性疾病[1]，是微血管的變態(tài)反應(yīng)性疾病，可能導(dǎo)致腎臟嚴(yán)重損傷。本病好發(fā)于學(xué)齡期兒童，多發(fā)于秋冬季節(jié)，常呈自限性[2]。病因尚不明確，多與感染，藥物，特殊食物等有關(guān)。主要引起機體的體液免疫紊亂。近年來許多學(xué)者認為許多病原微生物的感染在HSP 發(fā)病中起重要作用，且兒童感染相對高于成人[3]。根據(jù)其損傷相應(yīng)的靶器官，產(chǎn)生相應(yīng)的臨床表現(xiàn)，可將其分為單純皮膚紫癜型，關(guān)節(jié)型，腹型與腎型，常以皮膚典型的紫癜為首發(fā)癥狀。以腹部及關(guān)節(jié)癥狀為首發(fā)癥狀的患兒易誤診[4]。過敏性紫癜為自限性疾病，預(yù)后較好，但過敏性紫癜引起的腎臟損傷可影響患兒的生活質(zhì)量及預(yù)后，其大多預(yù)后良好，但有15%有持續(xù)腎臟損傷，約8%進展至腎臟衰竭[5]。本研究中，本研究通過對不同類型兒童過敏性紫癜病人的咽拭子培養(yǎng)及藥敏實驗，進行微生物感染的相關(guān)病因?qū)W檢查，現(xiàn)將詳細情況報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院2016-01～2018-12 入院治療的過敏性紫癜患兒200 例，將患兒按不同臨床型分為A 單純型（僅有皮膚紫癜）40例：男性23 例、女性17 例，年齡3～15 歲，平均年齡8.87±2.34 歲、B 關(guān)節(jié)型（皮膚紫癜伴關(guān)節(jié)癥狀）40例：男性20 例、女性20 例，年齡3～14 歲，平均年齡9.12±2.39 歲、C 腹型（皮膚紫癜伴胃腸道癥狀）40例：男性19 例、女性21 例，年齡3～13 歲，平均年齡8.82±2.45 歲、D 腎型（尿蛋白陽性，潛血大于3）40例：男性18 例、女性22 例，年齡3～15 歲，平均年齡8.99±2.97 歲、E 混合型（2 種以上癥狀同時存在）40例：男性19 例、女性21 例，年齡3～13 歲，平均年齡8.71±2.96歲。從A 型到E 型，患兒的病程是逐漸加重。另取在同期在本院進行健康體檢的健康志愿者100 例為對照組：男性48 例、女性52 例，年齡3～14 歲，平均年齡8.34±3.13 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2005 年歐洲兒童腎臟病防治委員會和歐洲風(fēng)濕病防治委員會及美國風(fēng)濕協(xié)會共同制定的lISP 診斷標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：就診前2wk內(nèi)使用過皮質(zhì)類固醇激素、免疫抑制劑；1wk 內(nèi)服用過抗組胺藥物。6組間患兒的年齡、性別等資料比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。患兒及其家屬均知情并簽署知情同意書，研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 IgM 和IgG 水平檢測 所有患兒均于第2d 清晨采取空腹外周靜脈血2wk，室溫靜置不超過8h，預(yù)計超過8h才能試驗的樣本則采集后即刻存放在4℃冰箱中，預(yù)計超過24h 后才能試驗的樣本則采集后即刻于-20℃冰箱保存，成批檢測。同時采用ELISA法測定血清TORCH 抗體IgG 和IgM。所有受檢者均上海信帆科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒，批號為AH20151210。操作過程如下，在試劑盒附帶的板孔內(nèi)加入各10μL 的標(biāo)準(zhǔn)品、待檢血清與質(zhì)控品[7]，然后加入用酶標(biāo)記過的抗體工作液100μL，在室溫的條件下?lián)u床孵育2h，孵育結(jié)束后用PBS 溶液清洗5～6 次，再加入底物工作液100μL，繼續(xù)搖床孵育15min，加入100μL 的終止工作液，持續(xù)5s，以終止反應(yīng)，然后用分光光度計在波長420nm 處檢測樣品的吸光度值，根據(jù)試劑盒附帶的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清樣品中IgG 和IgM 的濃度[8]。

1.2.2 患兒血清中補體C4 水平的檢測 應(yīng)用來自浙江伊利康生物技術(shù)有限公司的補體C4 檢測試劑盒，試劑盒批號為P151015B。微孔板的覆蓋用純化的人補體C4抗體，抗體被固定在微孔板上。檢測時向微孔中加入患兒的血清，血清中的補體C4與固定抗體（HRP 標(biāo)記）結(jié)合，構(gòu)成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，洗滌過后加入反應(yīng)底物TMB，HRP 催化TMB發(fā)生顯色反應(yīng)而呈現(xiàn)藍色最終在酸的作用下表現(xiàn)為藍色，顏色的深淺與血清中補體C4的水平呈正相關(guān)[9]。在波長450nm 條件下檢測樣品的吸光度，借助標(biāo)準(zhǔn)曲線來分析樣品中的C4水平[10]。

1.2.3 細菌培養(yǎng) 對所有患兒入院后次日清晨用約1%淡鹽水漱口后，將Dacron 拭子用力擦拭咽喉后壁2 次后取出，立即放入含脫脂奶、葡萄糖和甘油的轉(zhuǎn)運中，3h 內(nèi)分別接種丁含桿菌肽的巧克力培養(yǎng)基及TSA 羊血平皿上，置35℃含5%CO：的孵箱中，孵育24h～48h后取出，觀察細菌生長情況[11]。

1.3 觀察指標(biāo)

IgG、IgM 與補體C4 的檢測符合說明書標(biāo)準(zhǔn)的陽性條件，才能說明本實驗結(jié)果的可信性，否則需要重復(fù)實驗。篩選條件如下：陽性，標(biāo)本OD 值與臨界血清OD 值之比＞1.1；陰性，標(biāo)本OD 值與臨界血清OD 值之比＜0.9；可疑，標(biāo)本OD 值與臨界血清OD值之比在0.9～1.1 之間。咽拭子培養(yǎng)結(jié)果：選取其中單個菌落，并參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[12]對細菌進行結(jié)果鑒定。再根據(jù)培養(yǎng)細菌結(jié)果選擇多種抗生素進行藥敏測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

收集得到的數(shù)據(jù)進行分析時使用SPSS18.0 軟件，用χ2（%）檢驗表示其中計數(shù)統(tǒng)計，用t檢測（x±s）檢驗表示計量統(tǒng)計，多組間比較采用單因素方差分析，若P值＜0.05表明有統(tǒng)計學(xué)上的差異，數(shù)據(jù)可信。

2 結(jié)果

2.1 患兒血清中IgM和IgG水平的對比

患有過敏性紫癜的患兒血清中的IgM 水平顯著大于對照組，且隨著病程的加重，IgM 水平顯著上升（P＜0.05），對照組的IgG水平顯著高于過敏性紫癜患兒且隨著病程的加重IgG水平降低（P＜0.05）（見表1）。

表1 患兒血清中IgM和IgG水平的對比(x±s）

2.2 患兒血清中補體C4水平的對比

所有患兒血清中補體C4 的水平?jīng)]有顯著性差異（P＞0.05）（見表2）。2.3 患兒咽拭子培養(yǎng)的對比

表3 患兒咽拭子培養(yǎng)的對比（n，%）

所有患兒的咽拭子培養(yǎng)中，正常菌群（草綠色鏈球菌和表皮葡萄球菌）具有較高的陽性率且沒有顯著性差異（P＞0.05）。腎型患兒的乙型溶血性鏈球菌陽性率顯著高于其他患兒，而腹型患兒的金黃色葡萄球菌陽性率顯著高于其他患兒（P＜0.05）（見表3）。

表2 患兒血清中補體C4水平的對比（x±s）

3 討論

HSP 是累及全身小血管為主要特點的免疫性血管炎[13]。臨床表現(xiàn)為皮膚、黏膜出現(xiàn)瘀點瘀斑，常伴有四肢關(guān)節(jié)腫痛、腹痛、血便、血尿和蛋白尿。HSP 的發(fā)病可能是某種致敏原作用于機體，引起免疫受損及環(huán)境刺激所致的機體產(chǎn)生的抗原一抗體反應(yīng)，導(dǎo)致的以IgA 形成為主的免疫復(fù)合物沉積于小血管壁及小血管壁周圍組織，且通過補體激活自身系統(tǒng)引起小血管和其周圍組織炎癥反應(yīng)[14]。

發(fā)病誘因主要有感染、食物、藥物、化學(xué)因素、冷刺激、花粉、腸蟲以及疫苗接種等，隨著對該病認識上的不斷加深及檢驗技術(shù)的發(fā)展，對感染因素在過敏性紫癜的發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用有了更深的認識，現(xiàn)認為感染因素占第一位。各種病原體感染、遺傳易感性是該病的主要病因，HSP 成人和兒童均可發(fā)病，多發(fā)生于2～8 歲的兒童，男孩多于女孩，一年四季均有發(fā)病，以春秋兩季居多[15]。

目前國內(nèi)外關(guān)于HSP 病因?qū)W研究方面主要有：細菌研究發(fā)現(xiàn)，鏈球菌感染、幽門螺桿菌（HP）跟HSP 的發(fā)病關(guān)系密切[16]。

患有過敏性紫癜的患兒血清中的IgM 水平顯著大于對照組，且隨著病程的加重，IgM 水平顯著上升（P＜0.05），對照組的IgG 水平顯著高于過敏性紫癜患兒且隨著病程的加重IgG 水平降低（P＜0.05）；所有患兒血清中補體C4 的水平?jīng)]有顯著性差異（P＞0.05）；所有患兒的咽拭子培養(yǎng)中，正常菌群（草綠色鏈球菌和表皮葡萄球菌）具有較高的陽性率且沒有顯著性差異（P＞0.05）。腎型患兒的乙型溶血性鏈球菌陽性率（40.00%）顯著高于其他患兒，而腹型患兒的金黃色葡萄球菌陽性率（27.50%）顯著高于其他患兒（P＜0.05）；在咽拭子培養(yǎng)中，所有患兒的正常菌群具有較高的陽性率且沒有顯著性差異（P＞0.05）；腎型患兒的乙型溶血性鏈球菌陽性率顯著高于其他患兒，而腹型患兒的金黃色葡萄球菌陽性率顯著高于其他患兒（P＜0.05）。

鏈球菌感染后可出現(xiàn)皮膚紫癜，蛋白尿，血清補體水平下降，病理檢測提示紫癜性腎炎。血清中抗鏈球菌溶血素“O”陽性的發(fā)病概率為陰性患兒的10 倍。HP 感染后也可出現(xiàn)HSP 癥狀，隨著HP 被抗生素殺滅，病人癥狀、體征也隨之消失[17]。國內(nèi)學(xué)者研究表明HP 感染跟HSP 的發(fā)病特別是跟腹型HSP 的發(fā)病密切相關(guān)；HPV-B19 屬于動物微小病毒屬中的d、DNA 病毒，可引起人類多種疾病，近期國內(nèi)外研究顯示，HPV-B19 感染與過敏性紫癜的發(fā)生有關(guān)，可能是導(dǎo)致HSP 的相關(guān)病原體之一[18]。其他肺炎支原體、柯薩奇病毒、EB 病毒、乙型肝炎疫苗接種、甲型肝炎，接種甲肝疫苗、乙肝疫苗、風(fēng)疹疫苗、麻疹- 風(fēng)疹聯(lián)合減毒疫苗等引起HSP 均有報道，但具體機制未能闡明清楚[19]。

綜上所述，目前國內(nèi)外對于過敏性紫癜的病原學(xué)研究成為熱點，本研究對HSP 患兒及早檢測病原微生物感染的指標(biāo)，有針對性地預(yù)防及治療，可以達到縮短病程，減輕重要臟器損害的目的。