IVF促排卵不同卵巢反應病人血清let-7的表達及意義

趙鴻娟，胡 賓，陳秀娟，王 煜

（1.山東省立第三醫院婦產科，山東 濟南 250000；2.內蒙古醫科大學；3.內蒙古醫科大學附屬醫院生殖中心）

控制性超排卵（controlled ovrian hyperstimulation，COH）是輔助生殖技術的重要環節，是為了一次獲取適當數量及質量的卵子，受精形成胚胎后植入宮腔，以提高妊娠的機率。卵巢儲備功能是女性生育能力的重要標志，卵巢內卵泡數目隨年齡的增長不斷減少且質量逐漸變差，即卵巢儲備功能逐漸下降。卵子的數量和質量對IVF至關重要，一定的卵巢儲備功能是卵巢反應的前提[1]。卵巢反應性是指卵巢對促性腺激素的敏感程度，根據在促性腺激素（gonadotropin，Gn）作用下卵巢的反應性，可分為卵巢低反應、正常反應及高反應。卵巢對Gn刺激反應不良的狀態，稱為卵巢低反應。相反，當卵巢對Gn的刺激異常敏感，超出了預期的范圍與合理水平時，則稱為高反應，卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）是最常見的表現之一。卵巢低反應和OHSS是目前導致IVF治療周期取消的主要原因，因此，正確評價卵巢對COH的反應性，防止卵巢低反應和OHSS的發生，成為生殖領域的研究熱點。

Let-7是卵巢中含量最豐富的miRNA之一，其在卵巢的不同發育時期和不同細胞中表達不同[2]，在維持卵巢正常功能與卵巢疾病的發生發展中具有重要的作用，例如，參與卵泡發育的調控、卵巢激素的合成與釋放、卵丘-卵母細胞間的信息交流[3]、卵巢癌細胞的發展等過程。

近年來，卵巢功能方面的研究越來越多，但對于卵巢反應性的評估尚無明確標準。本文采用qRT-PCR法分別檢測卵巢高、中、低反應組病人月經期血清中let-7g、let-7f及let-7i的表達水平，探討let-7g、let-7f及let-7i可能參與調節卵巢生理的作用，初步評價其對IVF促排卵病人卵巢反應性的預測價值，為臨床評價卵巢反應性提供一條新的可能途徑。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2014-03～2015-11期間于醫院生殖中心因輸卵管因素或男方因素行IVF-ET的原發不孕病人40例，其中卵巢高反應組14例、中反應組14例、低反應組12例，新鮮周期均移植。入選婦女年齡25～42歲，平均31.6歲，月經規律，3個月內未服用過激素類藥物，無不良生活嗜好。分別在常規長方案促排卵之前的月經第二天，抽取外周血5mL，將上層血清提取，-80℃冰箱凍存待檢測。標本采集均征得內蒙古醫科大學倫理委員會批準及病人本人知情同意，所以標本有完整病例資料。

卵巢反應性分組參照：（1）卵巢高反應組[4]（滿足以下任意兩項）：①總卵泡數14個或單側卵巢卵泡數＞10個或獲卵數＞15個；②人絨毛膜促性腺激素（HCG）日雌二醇（E2＞12000pmol/L或E2峰值＞75～90百分位[5]；③有OHSS史或因OHSS風險致流產史；（2）卵巢中反應組：介于卵巢高低反應組之間，3個＜獲卵數＜14個；（3）卵巢低反應組：2011年歐洲人類生殖及胚胎學會年會上制定的博洛尼亞標準[6]，（滿足以下任意兩項）：①高齡（40歲）或存在卵巢反應不良的其它危險因素；②前次IVF周期卵巢低反應，常規方案獲卵數3個；③卵巢儲備下降（竇卵泡（AFC）<5～7個或抗苗勒氏管激素（AMH<0.5～1.1 ng/mL））。如果年齡或卵巢儲備功能檢測正常，病人連續兩個周期應用最大化的卵巢刺激方案仍出現卵巢低反應也可診斷。其他危險因素包括：影響卵巢儲備和對卵巢刺激反應的遺傳或獲得性的疾病，如染色體的數量和結構異常、基因突變（如Turner綜合征等）；既往的盆腔炎、子宮內膜異位癥、卵巢囊腫手術史、放化療（特別是烷基化的化療藥）史。

1.2 RT-PCR引物序列設計和合成：

為了使目標基因歸一化，正確反映不同標本的RNA產量和質量，cDNA合成效率中的變化趨勢，結合本實驗的特點，選取了血清中表達穩定的miR-16-5p作為內參基因。所有引物設計軟件基于Gen Bank數據庫的let-7g、let-7f、let-7i及miR-16-5p序列，設計特異擴增引物，引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成。合成的引物序列如下：

基因let-7g let-7f let-7i miR-16-5p上游引物序列（5'-3'）CCGCGTGAGGTAGTAGTTTGTACAGTTAAA GCGCGCTGAGGTAGTAGATTGTATAGTTAAA CGGCTGAGGTAGTAGTTTGTGCTGTTAA UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG下游引物序列（5'-3'）GTGCAGGGTCCGAGCT GTGCAGGGTCCGAGCT GTGCAGGGTCCGAGCT GTGCAGGGTCCGAGCT

1.3 定量PCR檢測let-7g、let-7f、let-7i及miR-16-5p的表達水平

1.3.1 總RNA提取取出保存的上層血清制備總RNA，RNA提取試劑購自寶生物工程（大連）有限公司Takara，根據說明書提取總RNA，置于-80℃冰箱保存備用。

1.3.2 RNA的純度及質量鑒定紫外線分光光度計檢測提取總RNA的吸光度（A）值，A260/A280值在1.8～2.1可進行下一步實驗，并用瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.3.3 let-7g、let-7f、let-7i及miR-16-5p的檢測 以RNA為模板進行反轉錄，獲得互補DNA，反轉錄試劑購自Takara公司，反轉錄條件：37℃60 min；85℃5s，采用實時熒光定量PCR試劑盒（Takara公司）擴增let-7g、let-7f、let-7i及miR-16-5p，熒光定量PCR儀（美國Bio-rad 7300公司）行定量PCR，反應參數為95℃30s，預變性95℃5s，60℃30s，溶解曲線分析95℃15s熒光檢測1次，共40個循環，記錄每個反應管中的熒光信號到達所設定的閾值時所經歷的循環數（Ct值），若未檢測到Ct值或復孔間Ct值之差>1，需要重復實驗。反應結束后根據溶解曲線分析產物是否單一，每組均設3個復孔。

1.4 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析，計量資料用單因素方差分析。顯著性檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 統計數據

Let-7g、let-7f及let-7i在中反應組病人血清中表達量最高，差異有統計學意義（P=0.014、P=0.001、P=0.008）；高反應組病人血清中let-7f的表達量高于低反應組病人，差異有統計學意義（P=0.028）；let-7g、let-7i在高反應組及低反應病人血清中的表達無顯著差異（P=0.704、P=0.310）。

2.2 臨床特征

體重指數：三組病人體重指數無明顯差異（P=0.403）；年齡：卵巢低反應組病人明顯比中、高反應組大，差異具有統計學意義（P=0.034）；Gn天數：卵巢低反應組病人明顯比中、高反應組病人用藥時間長（P=0.001）；Gn總量：低反應組病人比中、高反應組病人用量大，差異具有統計學意義（P=0.003），余兩組間無明顯差異（P=0.173）；基礎FSH水平：低反應組比高反應組水平高，差異具有統計學意義（P=0.008），而低、中反應組及中、高反應組之間差異無明顯統計學意義（P=0.091、P=0.264）；FSH/LH比值：低反應組比值＞2，且高于其余兩組，差異具有統計學意義（P=0.003），余兩組組間無明顯差異（P=0.163）；AMH：卵巢低、中、高反應組中呈上升趨勢，差異無統計學意義（P=0.437）；AFC：卵巢低、中、高反應組中呈上升趨勢，差異無統計學意義（P=0.145）獲卵數：卵巢低、中、高反應組病人逐漸增加，三組間差異具有統計學意義（P=0.001）；新鮮周期胚胎移植后妊娠率：三組病人分別25.0%、57.14%和42.86%。

3 討論

近期國外研究發現，let-7a、b、d、f、h在團頭魴卵巢發育I期至V期逐漸升高，VI期顯著下降，let-7可能在其卵巢發育中發揮重要作用[7]。本實驗團隊前期高通量測序的技術分析早期流產蛻膜和正常早孕蛻膜中mi RNAs的表達譜顯示[8]，let-7家族高豐度表達，qRT-PCR顯示let-7f、let-7g和let-7i在流產蛻膜中的表達顯著低于早孕蛻膜中的表達，let-7i在早孕蛻膜中表達顯著升高[9]，這些都提示let-7可能參與早期流產。

IVF中，年齡大的病人COH時間長，因對Gn的反應性下降而使用量增多，胚胎的著床率及妊娠率降低，妊娠后流產、早產及子代染色體異常幾率也增高[10]。Chuang[11]等研究認為，年齡是妊娠率的獨立預測因子，女性的生育潛能與年齡密切相關，35～41歲女性不孕的概率比30～35歲女性增加一倍。本研究中卵巢低反應組病人明顯比其余兩組病人大、Gn天數長、Gn總量也最多，結果與上述描述相符。由于個體間存在差異，且女性生理年齡常常與卵巢功能不完全相符，因此，實際年齡預測結果有出入，應結合其他預測指標綜合評估。

生理狀態下，隨卵巢功能的下降，卵泡刺激素（FSH）及黃體生成素（LH）水平升高。在卵巢反應不良病人中，FSH的水平升高，導致卵泡生長及消耗加快，加速卵巢功能的衰竭。本研究中，卵巢低反應組病人基礎FSH水平最高。而在一項回顧性研究中[12]，對689例IVF病人以獲卵數為依據將病人分為低反應（0～3枚）、中反應（4～15枚）及高反應（16枚以上）三組，根據血清FSH的水平為指標預測卵巢的反應性，結果顯示FSH作為預測因子是有限的。本研究中卵巢低反應組病人FSH/LH＞2，且高于中、高反應組病人，差異具有統計學意義，目前影響卵巢儲備功能和卵巢反應性的基礎血清FSH/LH比值的閾值目前尚無統一標準，文獻報道從＞2.0～3.6不等[13]。

AMH屬于β2轉化生長因子家族的糖蛋白，2015年荷蘭的一項大型觀察性研究得出結論，干預前AMH能準確預測使用促性腺激素釋放激素（GnRH）拮抗劑方案者的卵巢反應性，AMH＞4.5ng/mL提示卵巢反應性好，而且AMH＜0.8ng/mL則提示卵巢無反應[14]。目前多項研究認為直徑2-6 mm的AFC數目更能定量直接的反映卵巢儲備功能。AFC減少，尤其是 9h，在預測卵巢低反應時，敏感度為84%，特異度為79%[15]。在本研究中，卵巢低、中、高反應組中，血清中AMH水平呈上升趨勢。目前尚無能夠獨立評價卵巢儲備功能的特異性標志物，應考慮個體差異，通過聯合多種指標進行評估，除上述外，還有獲卵數、HCG注射日血清E2峰值、抑制素B、卵巢體積及卵巢基質血流等。

研究發現，在卵泡發育中，miR-143、let-7a和miR-125b的表達可被FSH抑制[16]。let-7c在始基卵泡中的表達很少，在初級卵泡、次級卵泡和竇卵泡中持續表達[17，18]，其主要存在于顆粒細胞中[19]，顆粒細胞可促使卵巢周圍微血管的生成。let-7c在MⅠ期卵母細胞周圍的顆粒細胞中的表達明顯高于MⅡ期。let-7c的水平增加，卵母細胞的成熟率升高[20]，這提示let-7c參與卵母細胞與周圍顆粒細胞的相互作用。let-7b可通過轉化生長因子β（TGFβ）信號轉導途徑影響雌激素的分泌[21]。let-7c的表達可被雄激素（A）抑制，使用抗A藥物可解除let-7c的表達抑制，并緩解A介導的細胞增生，而let-7c可通過抑制雄激素受體（AR）的轉錄過程從而抑制AR的表達及其活性[22]。多囊卵巢綜合征（PCOS）病人存在高雄激素血癥，Ding等[23]檢測病人血清mi RNA發現，let-7c的表達下調。

本研究中，卵巢低、中、高反應組病人獲卵數依次升高，而中反應組新鮮周期胚胎移植后的妊娠率最高，低反應組最低。qRT-PCR結果顯示，卵巢中反應組病人血清中let-7g、let-7f及let-7i在相對表達量最高，提示基礎血清中let-7g、let-7f及let-7i的表達水平可能與IVF病人卵巢反應及其妊娠結局有一定相關性。

Let-7與女性內分泌激素調節、卵泡發育之間存在一定的相互作用，因此而影響卵巢功能。我們的研究是相對較小的病人群，雖然研究結果顯示let-7的表達存在差異，但顯然需要進一步擴大樣本量或改變COH方案等方面進行研究，探討let-7是否可能作為IVF病人卵巢反應性的預測因子。