凝縮蛋白復合物亞基NCAPG增強非小細胞肺癌鉑類藥物敏感性的機制研究

朱荔豐，丁曉芬，郭瑪麗，蘇標華，樊燕丹，孫英明，2，李智軍

（1.福建醫科大學附屬三明第一醫院腫瘤內科，福建 三明 365001；2.美國俄亥俄州立大學Wenxer醫學中心放射醫學系；3.內蒙古自治區人民醫院放射治療科）

肺癌是我國乃至全世界發病率及死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）約占90%[1]。由于肺癌早期癥狀不明顯，約40%～60%患者就診時已發生局部或遠處轉移。盡管隨著肺癌的治療進入靶向時代和免疫時代，但僅僅約20%～40%患者能從中獲益，總體而言肺癌預后仍較差，五年生存率只有16.8%[2]。化療是目前延長晚期肺癌患者生存期及提高生活質量有效的方式，而含鉑兩藥方案是晚期肺癌治療的基石。順鉑于1978年被美國FDA批準用于惡性腫瘤治療，目前仍為肺癌化療的一線用藥。其作用機理為鉑原子與DNA形成交聯反應（crosslink），使其發生DSB導致細胞凋亡。雖然鉑類藥物給肺癌患者帶來了一部分臨床獲益，但以鉑類為基礎的肺癌化療僅僅只有7～9個月的PFS，克服順鉑耐藥一直是全世界科研人員追蹤的熱點[3]。

NCAPG是一種有絲分裂相關的染色體凝縮蛋白，是由1015個氨基酸組成114.5KDa的蛋白。目前研究表明，NCAPG在前列腺、肝癌等腫瘤中異常表達[4，5]。NCAPG參與有絲分裂染色體凝聚，與細胞周期有關，其主要功能使染色體重組為棒狀有絲分裂染色體，確保細胞分裂過程中姐妹染色單體的分離。Chengwu Gong等報道，其可以影響肝細胞肝癌增殖、遷移，并促進其凋亡[4～6]。然而，NCAPG在肺癌中功能研究甚少，本研究通過生物信息學結合體外實驗，探索NCAPG在非小細胞肺癌中的功能。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料及試劑

NCAPG過表達質粒委托上海吉瑪公司合成，NCAPG抗體（Abcam公司Cat No.226805），BCLAF1/BTF抗體（Abcam公司Cat No.ab226830），BCL2抗體（Abcam公司Cat No.ab32124），Cleave-PARP抗體（CST公司Cat No.#9548），γ-H2AX（Ser139）CST公司Cat No.#5438）。主要儀器：ECO2150型二氧化碳細胞培養箱（德國梅德勒公司），FACS Calibur型流式細胞儀（美國BD公司），全自動酶標儀ELX800NB（美國BIOTEK公司），PCR儀（美國Bio-Rad公司），激光共聚焦顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養HT-1975細胞10%胎牛血清、10%青霉素鏈霉素雙抗的PRMI-1640完全培養基培養于37℃、5%CO2、90%濕度的培養箱中，常規換液傳代。轉染質粒參考lipofectmin3000 protocol。

1.2.2 Western Blot檢測蛋白表達60～100mm細胞培養皿培養NCI-H1975細胞，藥物處理前PRMI-1640饑餓6h，用PIPA buffer收集細胞，提取總蛋白，樣品進7.5%～10%SDS－PAGE凝膠電泳后，轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉TBST封閉1h，一抗4℃過夜，TBST洗膜，加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，ECL發光液顯影。

1.2.3 免疫熒光 將多聚賴氨酸包被24mm玻片置入6孔板中，5×105接種于6孔板中，藥物處理完成后，使用4%多聚甲醛固定20min，曲拉通100通透后，以5%BSA封閉1h，一抗4℃過夜，PBST洗5次，加入不同熒光標記的二抗，室溫孵育1 h，Hochest33342染核5min，PBST洗5次后，上機檢測。

1.3 統計學方法

采用SPSS 11.0軟件進行統計處理，各指標數據采用均數±標準差表示，各組均數比采用單因素方差分析（One-way ANOVA），多組比較采用LSD法，P＜0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 NCAPG在肺癌組織中高表達、與肺癌分期及分化呈正相關

通過Oncomine數據庫來自Hou等提供數據庫（見圖1A），其中肺癌組織45例，癌旁組織65例（見圖1A），其余為Oncomine數據（見表1）。我們發現NCAPG肺癌組織中高表達（見圖1B），在TCGA數據庫中無論腺癌組織（腺癌483例，癌旁347例）還是鱗癌組織組織（鱗癌486例，癌旁338例）中NCAPG表達均較癌旁組織表達升高（P＜0.05），免疫組化標本中可以明顯觀察到腫瘤組織NCAPG高表達（見圖1C），其表達定位于細胞核中。通過Gepia網站分析，NCAPG表達與肺癌分期及分化呈正相關（見圖1D、1E），綜上所述，我們可以認為NCAPG作為一個癌基因參與了肺癌發生、發展的過程。

表1 Oncomin數據庫中肺癌組織與癌旁組織NCAPG表達情況

2.2 NCAPG高表達與預后呈負相關，與化療療效正相關而與放療療效無關

我們用TCGA數據庫和KM PLOTTER數據庫評估了NCAPG與非小細胞肺癌預后的關系，TCGA數據庫（見圖2A）及KM PLOTTER數據庫（見圖2B）均提示其表達與患者預后負相關。同時我們在KM PLOTTER數據庫分析NCAPG表達與放化療的關系（見圖2C）。患者接受化療后，NCAPG高表達患者預后明顯優于NCAPG低表達患者（P＜0.05）（見圖2D、2E）。對于未接受化療患者，NCAPG高表達預后不佳（P＜0.05）。令人意外的是，即使患者接受放療，NCAPG表達如何與預后無關（P＞0.05），然而在未接受放療患者中，NCAPG高表達的患者預后依然較差（P＜0.05）（見圖2F）。該結果預示著NCAPG表達與患者化療敏感性有關，提示NCAPG高表達患者更能從化療中獲益。

2.3 NCAPG通過調節BCLAF1增強肺癌細胞對順鉑敏感性

我們在Oncomine數據庫探索NCAPG表達量與順鉑敏感性的關系，發現在順鉑敏感的肺癌患者中，NCAPG表達量升高（見圖3A）。進一步分析NCAPG在肺癌不同順鉑敏感性相關基因，我們發現在無論順鉑是否敏感患者中，BCLAF1與NCAPG表達均呈正相關，其表達相關性R=0.779，表明BCLAF1與NCAPG表達高度一致（見圖3B）。為了進一步驗證上述結果，使用TCGA數據庫再一次驗證BLCAF1與NCAPG之間相關性，呈明顯正相關，R=0.45，P＜0.05（見圖3C）。接著我們構建了NCAPG過表達質粒，其隨著NCAPG表達升高，BCLAF1也隨之升高，并且順鉑能誘導BCLAF1表達，同時抑制了BCL2表達（見圖3D）。我們又檢測了PARP剪切體，過表達NCAPG對細胞凋亡作用不明顯，但是表明NCAPG過表達與順鉑具有協同作用。我們再一次用免疫熒光法驗證DNA損傷程度，我們發現過表達NCAPG能略微造成DNA損傷，但與對照組比無明顯差別，過表達NCAPG依然能顯示出和順鉑的協同作用（見圖3E）。

3 討論

NCAPG編碼染色體凝集蛋白復合體的一個亞單位，負責有絲分裂和減數分裂過程中染色體的凝聚和穩定。先前研究表明NCAPG參與包括前列腺癌、兒童膠質瘤、腎癌、多發性骨髓瘤、黑色素瘤等多種腫瘤的發生、發展[7，8]。我們運用利用生物信息學分析，研究發現NCAPG是肺癌發生發展的關鍵基因。此外，近年來越來越多的證據表明，NCAPG的異常表達與腫瘤發展有關。有學者通過加權基因共表達網絡分析，NCAPG是一種腫瘤生物標志物[9]。同時，我們通過分析來自Oncomine數據庫的5個微陣列數據，均發現NCAPG在NSCLC中上調。目前國內外對NCAPG對腫瘤增殖、遷移等影響較多，本研究首次發現NCAPG與化療患者預后相關，從另一個行的角度剖析NCAPG的作用。由于鉑類為主的化療是目前NSCLC治療的標準方案，我們推測NCAPG表達高患者能從化療獲益可能與其能增加化療敏感性有關。我們通過數據庫分析，得到BCLAF1可能是NCAPG作用的關鍵因子。

BCLAF1是一個該基因編碼一個轉錄抑制因子，與BCL-2蛋白家族的幾個成員相互作用。該蛋白過表達可誘導細胞凋亡，bcl2蛋白共表達可抑制凋亡[10]。該蛋白定位于整個細胞核的點狀結構，并在經歷凋亡的細胞中重新分布到核膜附近的區域。文獻報道BCL-2的抗凋亡作用是順鉑耐藥關鍵基因[11]。

我們的研究表明，過表達NCAPG即使能誘導BCLAF1表達，但是沒有明顯促進凋亡作用，Cleave PARP并沒有明顯升高，表明這種促凋亡作用可能被其他抗凋亡蛋白對其有拮抗作用，當用順鉑處理后，這種拮抗作用對抵消，NCAPG過表達很好顯示出了與順鉑的協同作用。

我們雖然初步討論了NCAPG化療增敏的機制，當也在一定缺陷，未進行BCLAF1的挽救實驗，只能間接直接證明NCAPG通過BCLAF1調節非小細胞肺癌化療敏感性。本研究結果表明，NCAPG高表達患者預示著更容易從化療中獲益，并能逆轉其高表達帶來的預后不良因素，為個體化治療提供了理論基礎。