輕中度肝纖維化大鼠肝臟3.0 T MR表觀擴散系數與基質金屬蛋白酶-1表達的相關性研究

范 龍，王松海，邱麗莉，羅毓媛，張凱航

（1.海南醫學院第二附屬醫院放射科，海南 海口 570311；2.海口市中醫醫院放射科）

細胞外基質（extracellular matrix，ECM）[1，2]的逐漸沉積是導致肝纖維化進展的重要途徑，而基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）可特異性降解ECM。MMPs家族中基質金屬蛋白酶-1（matrixmetalloproteinase-1，MMP-1）廣泛存在于人體中[1，2]，被肝細胞、枯否氏細胞等分泌，是組織肝纖維化進展的主要蛋白酶原[3，4]。MMP-1在肝組織中的表達也可以客觀反映肝纖維化病理程度。

美國肝臟疾病研究協會指南上[5]提出F2期肝纖維化對臨床治療選擇上具有重要的意義。Ronot[6]等研究結果也支持中度肝纖維化是影響慢性肝病預后的重要一步。MRI-DWI目前已經是較成熟的功能成像技術[7～10]，ADC值可在體量化評估肝纖維化，在分子生物學評估研究中具有一定的前景。本研究旨在研究輕中度肝纖維化肝臟ADC值變化與MMP-1 mRNA的表達相關性，為下一步MMP-1基因沉默干擾肝纖維化提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 動物模型建立

實驗大鼠來源于海南省實驗動物中心，采用隨抽樣機法分為模型組和對照組。本研究中大鼠模型組總共32只，體質量165～206g，造模采用腹腔注射豬血清（市場購買豬血、離心取血清）法[7]，劑量0.5mL/次，每周2次，食物亦購自海南醫學院醫學動物實驗中心，常規自來水飲用。

1.2 MRI-DWI及后處理計算ADC值

MR檢查使用西門子3.0 T磁共振機（德國），專業實驗動物線圈，后處理軟件[Function Tool（GE AW 4.4）]。技術掃描方案及參數參考戰躍福[7]等研究:掃描前6h禁止飲食、飲水，采用戊巴比妥鈉（1%）1.0 mL/100 g體質量腹腔注射麻醉。為防止過度呼吸運動及檢查室溫度過低采用自制棉帶腹部加壓固定，體位采用俯臥位，并調整肝臟位于線圈中心。MRI-DWI檢查b值=800 s/mm2，SE-EPI序列加脂肪抑制。掃描參數參考戰躍福等[7]研究:TR=3000 ms，TE=75.6 ms，層間距=0 mm，層厚=3.0 mm，NEX=8，FOV=100mmX100mm，矩陣=192×192。專配后處理工作站，取肝臟3個感興趣區取平均值[7]，距離肝包膜應＞1.0cm，盡量避開肝內膽管、肝臟血管等干擾。

1.3 肝臟組織病理學檢查（HE、Masson三色染色、網狀纖維染色）影像學檢查完成后過量麻醉劑處死大鼠，采用

4%多聚甲醛左心灌注固定以排除血液對組織學標本的影響。盡量選擇影像肝臟感興趣區靶標本取材，病理學檢查。病理結果判讀由病理科兩位高年資主治醫師以上判讀結果。根據中華醫學會共識[11]。因為共識[11]中更加注重顯著肝纖維化的臨床意義（METAVIR≥S2或Ishak≥S3定義為顯著纖維化），因此本研究將S1期歸為輕度肝纖維化組，S2、S3期歸為中度肝纖維化組，

1.4 MMP-1 mRNA檢測

根據解剖學定位選取與肝臟DWI成像ROI相同區域肝臟組織進行Real time PCR檢測。按總RNA試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）說明書提取肝臟總RNA。MMP-1、G3PDH Real Time-PCR擴增引物（上海生工合成）根據Okamoto[12]、Wasser[13]設計。MMP-1，forward primer:（5’-TCG TGA GAA TGT CTT CCC ATT-3’），reverse primer:（5’-TCTTGGATTG ATTTGAGATAAGTGAAATC-3’）；G3PDH forward primer:5’CCC TTC ATT GAC CTC AAC TAC ATGG-3’，reverse primer:5’-CAT GGT GGT GAA GAC GCC AG-3’。Real-time-PCR根 據TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0、SYBR Premix Ex Taq II說明書進行檢測肝臟組織MMP-1表達。

1.5 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件包，數據以表示。統計學方法采用單因素方差分析、SNK法、Pearson相關分析。

2 結果

2.1 大鼠肝纖維化模型的建立及病理組織學檢查

模型組大鼠32只中，圖像不符合分析要求2只，最終符合輕度肝纖維化組11只，中度肝纖維化組15只。對照組8只大鼠均完成DWI檢查。

HE染色:S1期肝纖維化匯管區可見纖維增生（見圖3A），到中度肝纖維化則可出現橋接纖維化（見圖4A）；Masson三色染色:S1期肝纖維化膠原纖維可見染色（圖3B），到中度肝纖維化組藍染則增多（見圖4B）。網狀纖維染色:S1期肝纖維化可見黑褐色染色（見圖3C），到中度肝纖維化組黑褐色染色明顯增厚，并可出現小葉內瘢痕（見圖4C）。

2.2 影像學及分子生物學結果（見表1）

表1 三組大鼠肝臟ADC值及MMP-1 mRNA相對表達量

2.3 三組大鼠肝臟ADC值及MMP-1 mRNA表達相關性

對照組、輕-中度肝纖維化組大鼠肝臟ADC值與MMP-1 mRNA表達Pearson相關系數為0.64（P＜0.05），結果提示呈正相關。

3 討論

3.1 肝纖維化分組及模型的選擇及意義

美國肝臟疾病指南上[5]也指出肝纖維化F2期被認為具有重要的臨床意義；國外學者Ronot[6]等認為中度肝纖維化是慢性肝病診斷和治療的重要階段。因此本研究根據指南及學者的研究[5，6]選擇輕-中度肝纖維化組的功能影像及分子生物學研究更具有臨床價值。本文采用的是免疫法豬血清腹腔注射造模，其肝纖維化形成過程雖然較長，但確是研究肝纖維化轉歸較可靠的模型[7，14，15]，為下一步MMP-1基因沉默干擾肝纖維化提供實驗基礎。

3.2 影像學評估肝纖維化-肝硬化

目前超聲彈性成像雖已經寫進肝纖維化評估指南中，是目前比較可靠的影像學評估方法，但對操作者仍具有一定的要求，且普及并不是太廣，對基層醫院推廣價值仍有一定限制；CT灌注成像評估參數較多，評估價值也比較顯著，臨床應用前景也非常廣泛，但輻射劑量仍是制約其全面推廣的主要原因；磁共振功能成像，如DWI，MRS，PWI，BOLD等多種影像技術方法，其中DWI應用最為廣泛且最具有前景。ADC值雖已廣泛應用于肝纖維化的研究[7～10]，且b值選取800 s/mm2普遍認為圖像質量清晰，評估能力最佳，但對于早中期肝纖維化的診斷價值尚有一定爭議。

3.3 MMP-1 mRNA表達在輕中度肝纖維化中的意義及ADC值反映MMP-1表達的能力

本文研究結果輕-中度肝纖維化MMP-1 mRNA表達呈下降趨勢，MMP-1廣泛存在于肝臟中，被肝細胞、枯否氏細胞等分泌，由輕度肝纖維化進展為中度肝纖維化，肝臟炎性反映加重，MMP-1必然亦隨之減少[3，4]，因而MMP-1在肝組織中的表達水平可以真實反映肝纖維化程度。本文研究結果顯示輕度肝纖維化進展為中度肝纖維化，大鼠肝臟DWI-ADC值同病理分期表達相一致，且同國內外學者研究一致[7～10，15]，ADC降低有統計學意義，是由于I、III型膠原纖維的增加，導致水分子彌散受限所致。

戰躍福[7]研究結果提示ADC值不能區分S1與S2期、S2與S3期，國內范國華[8]研究結果也提示ADC值不能區分S2與S3期；有學者指出原因可能由于存在部分病例病理分期上的重疊；綜上所述ADC值在評估肝纖維化精度上確實存在較多的影響因素，仍有待進一步研究。本研究結果顯示S1期與S2、S3期間肝臟ADC值及MMP-1 mRNA表達均具有統計學意義，雖然輕-中度組間仍有一部分病理分期存在重疊，但較戰躍福[7]、范國華[8]等研究在分組上更具有臨床探討價值。

3.4 研究不足及展望

第一本研究結果提示輕-中度肝纖維化大鼠肝臟ADC值與MMP-1表達呈正相關，但關于兩者是否具有相關性，需要下一步通過反義抑制MMP-1表達，再深入探討兩者之間的關系。第二難以精準實現影像上感興趣區選擇與組織病理學標本的完美對照，下一步擬引進計算機信息學圖像分割方法予以解決。